Biochemie von HemQ

Vor kurzem wurde in Gram-positiven Bakterien ein neuer Syntheseweg für die Herstellung der prosthetische Gruppe Häm b entdeckt. Das Enzym HemQ spielt darin eine zentrale Rolle, jedoch ist derzeit fast keine Information über seine konkrete katalytische Aktivität und den Mechanismus der chemischen Umwandlung bekannt. In diesem Projekt sollen daher erstmalig die Struktur- Funktionsbeziehungen von HemQ mit Hilfe eines breiten Spektrums an biochemischen und biophysikalischen Methoden untersucht werden. Aufgrund der Tatsache, dass eine große Anzahl von Gram-positiven Bakterien wichtige Krankheitserreger sind und für die Pathogenizität dieser Erreger Hämenzyme essentiell sind, ist HemQ ein attraktives Ziel für eine neue Generation von Antibiotika. Die Grundlage dafür ist aber die exakte Kenntnis der Struktur-Funktionsbeziehungen von HemQ. Im Rahmen dieses Projektes werden daher vier Modellenzyme aus unterschiedlichen Zweigen dieser Proteinfamilie vergleichend untersucht. Dazu gehören HemQs aus gefährlichen und weit verbreiteten Krankheitskeimen wie Listeria monocytogenes und Staphylococcus aureus (Firmicutes), HemQ aus dem Actinobacterium Corynebacterium diphteriae, und schließlich HemQ aus dem Archaeum Sulfulobus sulfataricus. Diese vier Proteine werden rekombinant in E. coli in ihrer Apoform (unbeladen) und Holoform (beladen mit Coprohäm bzw. Substratanaloga) hergestellt und durch eine breite Palette an zeitaufgelösten spektroskopischen Methoden analysiert. Zudem soll die Struktur dieser Enzyme in atomarer Auflösung durch Röntgenkristallographie, die Kinetik der Umwandlung von Coprohäm in Häm b und die zugrunde liegende Redoxchemie analysiert werden. Die experimentellen Untersuchungen werden in silico mittels moleculardynamischen Simulationen begleitet werden. Schließlich werden basierend auf diesen Daten durch Mutagenese Einzel- und Doppelmutanten dieser vier Modellenzyme hergestellt werden, um ein umfassendes Bild über die Rolle des Proteins in der Bindung und Umwandlung des Substrats und schließlich in der Freisetzung von Häm b zu erhalten. Für künftige Studien über das rationale Design von Inhibitoren von HemQ, d.h. die Entwicklung neuer Antibiotika, wird diese Grundlagenforschung die Basis liefern.

In diesem Projekt wurde der Reaktions- und Wirkungsmechanismus des Enzyms Coprohäm Decarboxylase eingehend untersucht und weitestgehend aufgeklärt. Dieses Enzym katalysiert den letzten Schritt der Hämbiosynthese in sehr vielen, hauptsächlich Gram-positiven, Bakterien. Darunter befinden sich einige gefährliche Krankheitserreger, die multiple Resistenzen gegen übliche, etablierte Antibiotika aufweisen. Diese resistenten, pathogenen Bakterien sind gefährliche Krankenhauskeime, die für eine Vielzahl an Todesfällen jährlich weltweit verantwortlich sind. Coprohäm Decarboxylase ist ein vielversprechendes Ziel für die Entwicklung neuartiger antibiotisch wirkender Substanzen, da kein strukturverwandtes Protein in Menschen zu finden ist und eine Inhibierung dieses Enzyms für den Krankheitserreger letal ist. Um die Suche nach geeigneten Inhibitoren zielgerichtet gestalten zu können, ist es von großer Bedeutung die grundlegenden Struktur-Funktionsbeziehungen dieses Proteins aufzuklären. Dieses Projekt ist ein klassisches Grundlagenforschungsprojekt, in dem wir es geschafft haben das Zielprotein zuverlässlich und reproduzierbar herzustellen und zu reinigen, sowie zielgerichtete Punktmutationen einzuführen. Die vergleichenden biochemischen und biophysikalischen Studien des wildtyp Proteins und der zahlreichen Proteinvarianten ermöglichten es die einzelnen Schritte der mehrstufigen und komplexen Redox-Reaktion zu erforschen. Dieses Wissen ist die Grundlage für die Entwicklung hochspezifischer Inhibitoren, die darauf abzielen die Reaktion mechanistisch zu beeinflussen indem die Elektronenflüsse während der Redox-Reaktion manipuliert werden. Ein spezieller Forschungserfolg war es auch, neben der Aufklärung der Redoxchemie, die Reorientierung des Substrates während der Reaktion beobachten zu können. Diese strukturbiologischen Erkenntnisse sind die perfekte Grundlage um Inhibitorkandidaten zu finden, die eine sterische Blockade herbeiführen, die es dem Enzym unmöglich macht das Substrat korrekt zu verarbeiten. Diese Ergebnisse konnten in namhaften und renommierten wissenschaftlichen Journalen in mehreren Artikeln publiziert werden. Durch die Erkenntnisse, die im Rahmen dieses Projektes, gewonnen werden konnten, haben sich weitere wichtige und interessante Fragestellungen ergeben, die eine zielgerichtete sowie erfolgsversprechende weitere Forschung ermöglichen.