TGF-beta Signaltransduktion: Smad2/3 Kerntransportmechanismen

Der Wachstumsfaktor TGF-beta spielt eine zentrale Rolle in der Krebsentstehung. Binden dieses Proteins an Rezeptoren auf der Zelloberfläche bewirkt eine Modifizierung von intrazellulären Signalüberträgerproteinen (Smad2 und Smad3), die daraufhin als Komplex mit Smad4 in den Zellkern wandern. Smads dienen nicht nur der Signalweiterleitung in den Kern, sondern sie bewirken auch direkt das Ablesen von Genen, d.h. sie vermitteln die Antwort der Zelle auf das externe Signal. Kerntransport dieser Proteine ist ein zentraler Mechanismus des Signalweges. In Abwesenheit und in Anwesenheit eines Signals bleiben Smads nicht statisch im Kern, sondern sie werden ständig hin- und hertransportiert. Dieser Vorgang befähigt die Zelle, rasch auf wechselnde Signalintensitäten zu reagieren. Der genaue Mechanismus von Kernimport und Kernexport ist jedoch ungeklärt, insbesondere wie in TGF-beta aktivierten Zellen trotz konstitutiven Importes und Exportes eine Akkumulation der Smads im Kern erreicht wird. Eine genaue Kenntnis der exakten molekularen Mechanismen dieses Signalweges ist unerlässlich für die Entwicklung potentieller Inhibitoren, die als Chemotherapeutika Verwendung finden könnten. Das Ziel dieses Projektes ist die Charakterisierung des genauen Ablaufes des Import/Export-Vorganges sowie die Identifizierung der verantwortlichen Kerntransportproteine oder Karyopherine. Zuerst werden wir mit Hilfe von fluoreszierenden Smad Fusionsproteinen, die direkt in der Zelle mikroskopisch beobachtet werden können, die Kinetik von Kernimport und Kernexport untersuchen. Die Fluoreszenz dieser Proteine ist erst nach Aktivierung mittels Laser sichtbar, Proteinpopulationen in Kern und Cytoplasma können daher getrennt voneinander aktiviert und beobachtet werden. Dies wird wertvolle Erkenntnisse über den genauen kinetischen Ablauf des Prozesses liefern. Mittels spezifischem knock-down von etwa 8000 Proteinen mit Hilfe einer Library von siRNAs werden wir Proteinkomponenten, die für den Kerntransport benötigt werden, auffinden. Die Kandidaten werden danach mittels in vitro Kernimport in permeablisierten Zellen und mittels eines quantitativen in vivo Export Assays genauer charakterisiert werden.