Subzelluläre Lokalisierung der Toxinproduktion bei Cyanobakt

Inhalt: In der Natur sind viele Cyanobakterien mit giftigen Inhaltsstoffen bekannt, z.B. kleinere zyklische Peptid-Moleküle, die aus 6-14 Aminosäuren bestehen. Bekannt sind die Microcystine und Anabaenopeptine, die Enzyme wie Proteinphosphatasen 1 und 2A in allen höheren Organismen hemmen. Viele dieser Peptide werden nichtribosomal von sehr großen multifunktionalen Enzymkomplexen (die sog. Nichtribosomale Peptidsynthese) hergestellt. Die Toxine werden aus den Zellen herausgelöst oder aber aktiv transportiert, wobei hierzu der Mechanismus und die bestimmenden Faktoren nicht bekannt sind. Im allgemeinen werden die zellulären Gehalte und der Anteil der gelösten Toxin-Peptide im Freiland und im Labor als Durchschnittswert aus einer großen Zahl von einzelnen Zellen bestimmt. Dabei wird die Variabilität zwischen den Zellen übersehen, die z.B. durch transposable Elemente verursacht wird. Zur Beobachtung von Einzelzellen setzen wir speziell die Technik der Klick-Chemie ein, die es ermöglicht, sehr spezifisch Peptide über Standardfluorophore in den Zellen zu detektieren. Verschiedene chemisch-analytische Methoden zeigen deutlich eine gezielte Veränderung von Peptiden durch den Einbau einer Alkyn oder Azid-Seitenkette, welche dann für spezifische Farbstoffe als Reaktionsort in lebenden und fixierten Zellen zu Vefügung steht. Es ist vorallem die relative kleine Größe der Farbstoffmoleküle von Vorteil, die im Unterschied zu klassischen Antikörper- basierten Nachweisverfahren auch in vivo eingesetzt werden kann. Hypothesen: Ziel dieses Projektes ist es herauszufinden (1) in welchem Kompartiment zyklische Peptide hergestellt und gespeichert werden,. (2) die Menge der Peptidsynthese zwischen den Zellen variiert, was durch spontane Mutationen bedingt durch Transposasen entstehen könnte, (3) sich der Export von zyklischen Peptiden genotyp-spezifisch unterscheidet, was aufgrund der beobachteten Variation im intra- und extrazellulären Peptidgehalt einzelner Isolate zu erwarten wäre, (4) sich die Speicherung und der Export von zyklischen Peptiden unter physiologischen Stressbedingungen verändert. Methoden: Wir werden die Klick-Chemie Methodik in Verbindung mit hochauflösender Mikroskopie für die subzellluläe Lokalisierung der Toxin-Peptide einsetzen und zahlreiche Isolate vergleichen, die sich deutlich im intra- und extrazellulären Toxingeghalt unterscheiden (0-60% des Gesamttoxins). Die Peptide können durch Bildanalyse auf zellulärer Ebene quantifiziert werden bzw. können durch genetische Faktoren (zB Transposasen) entstandenen Subpopulationen mittels Durchflusszytometrie quantitativ rasch und genau erfasst werden. Fütterungsexperimente mit Alkyn- oder Azid Seitenketten wiederum können im Zeitverlauf aufzeigen, ob bestimmte markierte Peptide in das Außenmedium abgegeben oder vorallem in der Zelle gespeichert werden. Die vorhandenen unterschiedlichen Isolate bieten auch eine einzigartige Ausganglage, den Peptidtransport ins Medium unter physiologischen Stressbedingungen zu beobachten. Innovation: besteht in der erstmaligen Anwendung der Klick-Chemie zur Beobachtung der Toxin Peptide direkt in den Zellen von Cyanobakterien, was durch die Entdeckung und Charaktersierung der besonderen Multispezifität von Schlüsselenzymen im Zuge der Synthese erst möglich wird.