Lipidinteraktionen des T-Zellrezeptorkomplex

Alle Zellen in unserem Körper sind von einer Plasmamembran umgeben. Diese fungiert nicht nur als passive Barriere sondern als Ort des dynamischen und komplexen Zusammenspiels ihrer winzig kleinen Bausteine, den Proteinen und Lipiden, die für die Funktion der Plasmamembran verantwortlich sind. T-Zellen sind ein spezieller Zelltyp in unserem Immunsystem. Das wichtigste Protein in ihrer Plasmamembran ist der T- Zellrezeptor, dessen Aufgabe es ist, ein winziges Fragment eines Pathogens (das Antigen) zu erkennen, das ihm von einer anderen Zelle präsentiert wird. Durch diese Erkennung wird die T-Zelle aktiviert, d.h. eine Serie an zellulären Prozessen wird initiiert, die schließlich zur Immunantwort führt. Während die Proteine, die in diesen Vorgängen involviert sind, recht gut erforscht sind, ist die Rolle der Lipide größtenteils unbekannt. Das rührt daher, dass es sehr schwierig ist, Lipide in Experimenten zu untersuchen, vor allem in lebenden Zellen. Lipide und Proteine sind viel zu klein und nahe zusammen, um sie mit optischer Mikroskopie zu visualisieren, außerdem sind sie in ständiger Bewegung. Eine Strategie beruht daher darauf, einen nur sehr kleinen Teil der Moleküle mit einem Fluoreszenzmarker zu versehen, um sie als einzelne Objekte sichtbar zu machen. Diese können dann bei iherer Bewegung durch die Plasmamembran verfolgt warden, und ihre Interaktionen können beobachtet werden. Lipide sind in dieser Hinsicht aber problematisch, weil ihre Interaktionen mit Proteinen oft sehr kurzlebig sind. Ein weiterer Punkt, der Lipide spannend aber auch kompliziert macht, ist, dass sie nicht nur direkt mit Proteinen interagieren können, sondern auch gleichzeitig die 2-dimensionale Matrix der Plasmamembran darstellen. Es gibt tausende von Lipiden mit sehr unterschiedlichen Eigenschaften, und ihre dynamische Organisation bestimmt die lokalen Eigenschaften der Plasmamembran, was wiederum die Funktion von Proteinen moduliert. In dem vorliegenden Projekt wird ein neuer experimenteller Weg beschritten, um die Interaktion von Lipiden mit dem T-Zellrezeptor zu untersuchen. T-Zellen werden dafür auf mikrostrukturierte Substrate aufgebracht, die antigen-präsentierende Zellen simulieren. Dadurch ist es möglich, den T-Zellrezeptor in der Plasmamembran an bestimmten Orten festzuhalten und anzureichern. Nun kann man mithilfe hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie das Verhalten von Lipiden beobachten, und quantitative Parameter der Interaktion zwischen immobilisiertem T-Zellrezeptor und fluoreszenzmarkiertem Lipid extrahieren. Dies ermöglicht zum erstem Mal einen detaillierten Einblick in die Rolle von Lipiden im Prozess der T-Zellaktivierung.

Die Plasmamembran ist ein zentraler Knotenpunkt der zellulären Signalübertragung. Durch das komplexe Zusammenspiel von Proteinen und Lipiden entsteht hier eine Vielzahl ineinandergreifender funktioneller Einheiten. Ein bedeutendes und oft untersuchtes Beispiel hierfür ist die T-Zell - Antigenerkennung, die im Kontaktbereich zwischen einer T-Zelle und einer Antigen-präsentierenden Zelle (APC) stattfindet. Nach Erkennung eines spezifischen antigen-tragenden MHC-Moleküls auf der APC-Oberfläche durch den T-Zellrezeptor (TCR) kommt es zu einer Reorganisation der TCRs zu Mikroclustern, wo sich dann Signalmoleküle anreichern. Das Ziel dieses Projekts war es, neuartige mikro- und nanostrukturierte Oberflächen zur Zellinteraktion zu entwickeln, um mithilfe dieser die Organisation der T-Zell Plasmamembran und die hier stattfindenden Siganlisierungsprozesse direkt in lebenden Zellen zu untersuchen. Dazu verwendeten wir einerseits eine von uns entwickelte Micropatterning Methode, die darauf basiert, das zu untersuchende Protein in definierten Bereichen in der zellulären Plasmamembran zu fixieren und seine Interaktion mit Lipiden oder Proteinen mittels Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie zu untersuchen. Auf diese Weise konnten wir zeigen, dass das Zusammenspiel von membranverankerten Proteinen und Lipiden eher von ihrer physikalischen Größe als von der Bildung nanoskopischer geordneter Membrandomänen abhängt. Als nächstes modifizierten wir die Mircopatterning Methode, um die Interaktionskinetik zwischen dem TCR und einem intrazellulären Signalprotein zu untersuchen. Unser neuer experimenteller Ansatz ermöglichte es, spezifische Proteininteraktion von Hintergrundereignissen zu trennen, wodurch Fehlerquellen beseitigt und die Datenanalyse erheblich vereinfacht wurde. Bei Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie-experimenten am TCR stellten wir fest, dass seine nanoskopische Organisation ein relevanter Parameter für die T-Zell-Aktivierung war. Um diesen Aspekt auf quantitativer und mechanistischer Ebene zu untersuchen, entwickelten wir eine nanostrukturierte biomimetische Oberfläche, die die Antigen-präsentierende Zelle in Experimenten ersetzen sollte. Ziel war es, ein Biointerface zu schaffen, das erlaubt, Proteinabstände im Nanometerbereich exakt einzustellen, um so die Signalübertragung zu beeinflussen. Hierfür stellten wir DNA-Origami-Plattformen her, die mit TCR-Liganden dekoriert und auf Modellmembranen verankert wurden. Experimente, in denen T-Zellen mit diesen Oberflächen in Kontakt gebracht wurden, zeigten in der Tat, dass die räumliche Organisation von Liganden die T-Zellaktivierung stark beeinflussen kann. Wir fanden allerdings, dass dieser Effekt stark von der Kinetik der Ligand-TCR-Interaktion abhing. Bei Wechselwirkungen mit hoher Affinität waren für effiziente Aktivierung mindestens zwei Liganden im Abstand von 20 Nanometern nötig. Für pMHC, den physiologischen Liganden des TCR, dessen Bindung an den TCR schwach und von kurzer Dauer ist, war die räumliche Organisation jedoch kein relevanter Parameter: einzelne, durch DNA-Origami-Plattformen voneinander isolierte pMHC-Moleküle konnten T-Zellen effizient stimulieren. Dieser Befund hat weitreichende Auswirkungen auf unser mechanistisches Verständnis der T-Zell - Antigenerkennung und folglich auf das Design von T-Zell-basierten Immuntherapien.