Untersuchung von Cwp84, einer C. difficile Cysteinprotease

Clostridien bilden eine große Familie ubiquitär vorkommender, sporenbildender Bakterien. Während die meisten Spezies nicht pathogen sind, stellt Clostridrium difficile eine ernsthafte, teilweise lebensbedrohende Infektionserkrankung dar. C. difficile verursachte Durchfallerkrankungen sind die häufigste Infektion im Klinikbereich. Ursächlich für die Zytotoxizität pathogener Clostridienstämme sind bestimmte Toxine. Dem gehen die Wirtskolonisierung und Infiltrierung voraus; beide Prozesse werden von extrazellulären clostridialen Proteasen katalysiert, so z.B. kollagenabbauenden Metalloproteasen sowie weiteren Proteasen, die extrazelluläre Matrixproteine erkennen und degradieren. Von besonderer Bedeutung ist die oberflächenverankerte Cysteinprotease Cwp84, die in allen C. difficile Stämmen streng konserviert ist. Wir schlagen vor, ihre Struktur, Funktion und damit wesentliche molekulare Prinzipien der Wirtskolonisierung durch C. difficile aufzuklären. Wir konnten innerhalb der reifen 82 kDa Cwp84-Protease ein Segment nachweisen, das signifikante Homologie zu papain-artigen Cysteinproteasen enthält. Daraus konnten wir eine präliminäre Domänenstruktur der Protease ableiten, die eine widerspruchsfreie Erklärung der beobachteten Autodegrationsmuster liefert. Auf dieser Basis und einer teilweisen funktionellen Zuordnung einzelner Domänen ist eine systematische und zielgerichtete Analyse dieser wichtigen Protease möglich. Insbesondere wollen wir in einem ersten Schritt die genaue Domänenstruktur untersuchen und für die einzelnen Domänen eine komplette funktionelle Zuordnung durchführen; in diesem Zuge werden wir den Mechanismus der Aktivierung, der mit der Freisetzung einer Pro-Domäne einhergeht, aufklären. Zum zweiten werden wir den katalytischen Mechanismus von Cwp84 untersuchen und dabei insbesondere die Rolle der von uns postulierten katalytischen Dyade (Cys116, His262) sowie der Oxyanion Pocket (Gln110) validieren. Zum dritten werden wir Kristallstrukturen relevanter Domänen der Cwp84 bestimmen; dazu gehören insbesondere die katalytische Domäne und Active Site-gerichtete Inhibitor-Komplexe. Diese strukturellen Daten werden im Rahmen unseres vierten Arbeitspakets durch enzymologische Daten komplementiert. Zusammen sollen mittels der so gewonnen Struktur- Wirkungsdaten atomare Details der Aktivierung geklärt oder auch für die spezifische Substraterkennung wichtige Elemente identifiziert werden. Diese Elemente werden per Mutagenese validiert; zudem können darauf aufbauend neue (katalytische) Eigenschaften in die Cwp84-Protease engineered werden. Das gewonnene Verständnis bildet die Grundlage zum rationalen Design optimierter Active Site-gerichteter Inhibitoren und stellt somit einen Ausgangspunkt zur Entwicklung spezifischer diagnostischer und therapeutischer Verfahren bei C. difficile Infektionen dar.

Clostridien bilden eine große Familie ubiquitär vorkommender, sporenbildender Bakterien. Während die meisten Spezies nicht pathogen sind, stellt Clostridrium difficile eine ernsthafte Infektionserkrankung dar. Die Wirtskolonisierung und Infiltrierungsprozesse werden von extrazellulären clostridialen Proteasen katalysiert. Von besonderer Bedeutung ist die oberflächenverankerte Cysteinprotease Cwp84, die in allen C. difficile Stämmen streng konserviert ist und in diesem Projekt biochemisch und strukturell untersucht wurde. Der Fokus unserer Forschungsarbeiten wurde ursprünglich auf die Aktivität und Stabilität des Proteins gelegt. Basierend auf der präliminären Domänenstruktur konnten verschiedene Konstrukte kloniert und exprimiert werden. Um beobachtete Probleme mit der Homogenität der Probe und der Degradierung umzugehen bzw. zu verhindern, wurde eine nicht aktive Protein Mutante hergestellt, wo das aktive Cystein gegen ein Serin (C116S) substituiert wurde. Diese so genannte Tod-Mutante hat eine sehr hohe Überexpression und eine effiziente Reinigung aufweisen können. Die beobachtete Proteindegradierung wurde höchstwahrscheinlich durch die Autoprozessierung verursacht. Die exakte Schnittstelle wurde mit einer N-terminalen Edman Sequenzierung bestätigt und weist darauf hin, dass die Prozessierung zwischen Lysin 91 und Serin 92 stattfindet. Überraschenderweise konnte genau die gleiche Schnittstelle auch bei der nicht aktiven Cwp84 C116S Mutante aufgedeckt werden. Es ist bekannt, dass die Aktivierung bei den papain-artigen Proteasen durch Autoaktivierung erfolgen kann. Jedoch sind dabei auch zusätzliche trans (Intermolekulare) Aktivierungselemente möglich. Die Faltung eines Proteins wird oftmals durch Bindung eines weiteren Moleküls stabilisiert. Die Stabilisierung äußert sich unter anderem durch eine erhöhte Thermostabilität des Proteins. Es wurde bestätigt, dass die Ca2+ Ionen eine stabilisierende Wirkung auf das Protein aufweisen. Diese Ergebnisse sowie eine breite pH Stabilität des Proteins konnten mit Hilfe von der Thermofluor Methode nachgewiesen werden. Des Weiteren wurde auch die Bindung des Cwp84 Proteins mit einem Inhibitor Cystatin C bestätigt. Diese Erkenntnis hat eine signifikante Bedeutung und impliziert eine mögliche Proteindeaktivierung und eine darauffolgende Inhibierung der Infektion. Obwohl die Kristallstruktur des inaktives Proteins Cwp84 C116A zur Verfügung steht, ist eine detaillierte Aktivierung der Protease sowie der Mechanismus der Wirtskolonisierung noch nicht ausreichend aufgeklärt worden. Weitere strukturelle Untersuchungen, sind daher notwendig, um den genauen Mechanismus zu ermitteln. Bisher gewonnene Erkenntnisse, zusammen mit den vorliegenden Daten, bilden einen Ausgangspunkt zur Entwicklung spezifischer diagnostischer und therapeutischer Verfahren bei C. dificile Infektionen.