Pyranose Dehydrogenase für Bio-Brennstoffzellen

Enzymatische Bio-Brennstoffzellen wandeln mittels enzymatischer Katalyse chemische in elektrische Energie um. Miniaturisierte enzymatische Bio-Brennstoffzellen sind eine vielversprechende Energiequelle für implantierbare medizinische Geräte wie Herzschrittmacher oder Hörgeräte, sowie für die Energieversorgung elektronischer Geräte an isolierten Standorten aus natürlichen Brennstoffen. In enzymatischen Bio-Brennstoffzellen werden geeignete Redox-Enzyme mittels redox-aktiver Substanzen (Mediatoren) wie Osmium-Redox-Polymere an Elektroden gekoppelt. Glukose Oxidase wird meist als Modellenzym verwendet. Eine Reihe von alternativen Oxidoreduktasen bieten jedoch entscheidende Vorteile gegenüber Glukose Oxidase. Eines dieser Enzyme ist Pyranose Dehydrogenase (PDH), eine Flavin-abhängige Oxidoreduktase aus Agaricaceen. PDH kann Elektronen nicht an Sauerstoff übertragen und ist in der Lage, eine breite Palette an Monosacchariden, Oligosaccharides und Glykosiden zu oxidieren. PDH oxidiert Glukose und andere Zucker an mehr als einem C-Atom, wodurch die Elektronen-Ausbeute pro Substratmolekül und damit die coulombische Effizienz gesteigert wird. Die Eignung von PDH für Bio-Brennstoffzellen wurde bereits gezeigt. Wir wollen bestimmte, für solche Anwendungen relevante, Eigenschaften der PDH, durch zufallsgesteuerte sowie semi-rationale Strategien verbessern. Eine Mutanten-Expressions-Bank soll durch Fehlerhafte PCR sowie künstliche DNA-Rekombination hergestellt und im Mikrotiterplatten-Format nach Varianten mit verbesserter katalytischer Effizienz, erhöhter Stabilität, erhöhter Aktivität bei tiefen Temperaturen, sowie erhöhter Aktivität mit primären Oxidationsprodukten von PDH und anderen Enzymen wie Glukonsäure, 2-Keto-Glukose und 2-Keto- Glukonsäure, durchsucht werden. Verbesserte Enzymvarianten sollen besonders im Hinblick auf kinetische Werte mit verschiedenen Elektronen-Akzeptoren wie Cycloruthenate oder komplexiertes Os3+. Weiters beabsichtigen wir, verbesserte Enzymvarianten durch semi-rationale Protein-Modifikation herzustellen. Sobald eine dreidimensionale Struktur von PDH verfügbar ist werden Aminosäurereste um das aktive Zentrum identifiziert, mittels Sättigungs- Mutagenese gegen alle anderen Aminosäuren ausgetauscht, und die resultierenden Mutantenbanken auf Verbesserung obiger Enzymeigenschaften durchsucht. Weiters werden Aminosäuren mit relativ hoher räumlicher Flexibiltät durch Sättigungs-Mutagenese ausgetauscht, und die resultierenden Enzymvarianten auf erhöhte Thermostabilität durch "starrere" Aminosäuren untersucht. Verbesserte Enzymvarianten werden gemeinsam mit Redox-Polymeren mit unterschiedlichem Redox-Potential elektrochemisch charakterisiert, und Prototypen von Bio- Brennstoffzellen aus einer PDH-Anode und einer geeigneten Kathode werden hergestellt und getestet werden.

Das Projekt resultierte in der Konstruktion mehrerer Varianten von Pyranose Dehydrogenase mit veränderter N-Glykosylierung und verbesserten Eigenschaften bei der Verwendung an (anodischen) Elektroden von enzymatischen Bio-Brennstoffzellen oder Biosensoren aufgrund von verbessertem Elektronentransfer zur Elektrodenoberfläche. Wir tauschten vier im Wildtyp glykosylierte Asparagine gegen alle anderen Aminosäuren aus und selektierten auf Varianten mit unveränderten katalytischen Eigenschaften. Dies zeigte, dass zwei Stellen (N75 und N252) die biochemischen Eigenschaften nicht beeinflussen, wenn sie gegen Glutamin oder Glycin ausgetauscht werden. Eine weitere Stelle (N175) zeigte eine geringfügig verringerte Stabilität, die vierte (N319) kann nicht ausgetauscht werden und scheint für die Funktion des Proteins unabdinglich zu sein. N252, welches in gewisser Entfernung zum Aktiven Zentrum des Enzyms liegt, ist verantwortlich für die deutliche Über- Glykosylierung, die in vielen Pichia-Stämmen wie X-33 beobachtet wird. N75 und N175 liegen nahe des "Eingangs" zum Aktiven Zentrum. Von dort werden die Elektronen zur Elektrodenoberfläche transportiert, entweder direkt oder durch eine Mediator-Substanz. Das Fehlen der Glykosylierung an einer dieser Stellen führt zu verbessertem Elektronentransfer und höherer Energiedichte, das Fehlen an beiden zu einer beinahe zehnfachen Verbesserung im Vergleich zum Wildtyp, da der Abstand des Aktiven Zentrums zur Elektrodenoberfläche geringer ist. Zusätzlich ermöglicht diese Modifikation Direkten Elektronentransfer ohne Mediator-Substanz. Dieser Direkte Elektronentransfer ist bisher bei einfachen Flavoenzymen nicht beobachtet worden. Eine ebenfalls konstruierte Variante mit Austausch von N75, N175 und N252 brachte keine weitere Verbesserung und war instabiler als die anderen.Wir untersuchten auch die Produktion dieser Enzymvarianten und stellten fest, dass die bevorzugte Variante (Austausch an N75 und N175) in Pichia pastoris gut produziert werden kann, allerdings mit geringerer volumetrischer Ausbeute. Ein speziell modifizierter Stamm, der verkürzte Glykosylierungsketten am Enzym anbringen soll, funktionierte nicht wie erwartet, da die Glykosylierungsketten nicht homogen modifiziert waren. Die resultierenden Enzyme zeigten keine Verbesserung an der Elektrode, im Unterschied zu den Varianten mit gänzlich fehlenden Glykosyl-Ketten. Versuche der Modifikation der Gensequenz für eine funktionelle Expression in E. coli (ohne jegliche Glykosylierung) waren nicht erfolgreich. Die Arbeit an diesem Projekt hat zu großem Interesse an dem Enzym PDH und verwandten Enzymen für Anwendungen in Bio-Brennstoffzellen und Biosensoren geführt, und weitere Entwicklungen werden auch unter Einbeziehung von Industriepartnern aktuell diskutiert.