Monoklonaler Antikörper Mikroarray für Mikroben-Bestimmung

Staphylococcus aureus, ein Gram positiver fakultativ Infektionen verursachender Keim, ist ein natürlicher Bewohner der menschlichen Haut und der Schleimhäute. Es ist aber auch einer der häufigsten Erreger von Haut- und Gewebeinfektionen bis hin zu lebensbedrohenden Krankheitsbildern wie der Sepsis und dem toxischen Schock Syndrom. Aufgrund seiner möglichen Resistenz gegen Antibiotika und dem Vorhandensein von Virulenz Faktoren kann S. aureus eine breite Palette von Infektionen mit hoher Sterblichkeitsrate verursachen. Ein Vorliegen von Methicillin -Resistenz (MRSA) und des Virulenzfaktors Panton-Valentine-Leucocidin (PVL) beeinflusst maßgeblich den Schweregrad der S.aureus Infektion. Herkömmliche Methoden in der klinischen Routine basieren auf der Kultivierung des Erregers und dessen biochemischen Charakterisierung und benötigen daher bis zu 2 bis 3 Tage bis zur vollständigen Keim-Bestimmung. DNA basierte Methoden führen zwar schneller zu einem Ergebnis, haben aber den Nachteil, dass das Prozedere der DNA Isolierung und des Ansetzen der PCR-Reaktionen viele manuelle Schritte erfordert und zudem das Risiko einer Kontamination in sich birgt. Ergebnisse erhält man bei der schnellsten Methode nach 3 bis 4 Stunden ausgehend von der Blutkultur. Eine zufriedenstellende Sensitivität der PCR kann in der Regel nur für Reaktionen mit einem Primer-Paar erzielt werden. Die Detektion von mehreren verschiedenen Zielgenen würde somit die Durchführung von mehreren PCRs erfordern. Dem gegenüber eröffnet die Microarray Technologie die einzigartige Möglichkeit bis zu mehrere tausend Zielmoleküle in einer Reaktion zu erfassen. Daher werden wir in diesem Projekt die Möglichkeiten von Micorarrays zur parallelen Target-Detektion mit der Schnelligkeit und Spezifität von monoklonalen Antikörpern kombinieren. Dies wird die Bestimmung von Antibiotika Resistenzen als auch von Virulenz Faktoren in einer Reaktion ermöglichen. Aufgrund der hohen Inzidenz von S. aureus bei Infektionen eignet sich dieser Erreger sehr gut als Modell-Organismus. Im Rahmen des vorliegenden Projektes werden spezifische monoklonale Antikörper in einem hoch effizienten Verfahren hergestellt und auf Microarrays immobilisiert. Als Zielantigene wurden bereits aus einer umfangreichen Liste potentieller Markerkandidaten die Genprodukte von femA, mecA und lukS ausgewählt. Für die Charakterisierung werden die Ziel-Antigene aus Bakterien Lysaten isoliert und auf den Chip aufgebracht. Zur Antigen-Detektion werden 2 verschiedene Signal-Detektions-Methoden verglichen: (1) Fluoreszenz und (2) on-line erfasste Kapazitätsänderungen an interdigitierenden Elektroden eines Biochips mit elektronischem Readout. Nach dem Erreichen von ausreichender Sensitivität und Spezifizität wird die Methode im klinischen Labor getestet und die Grundlagen für die Entwicklung und Etablierung von neuen Tests für weitere Erreger vorangetrieben. Dies soll letztendlich künftig die parallele Charakterisierung von allen wichtigen Erregern erlauben.

Infektionserkrankungen stellen eine große Herausforderung im Klinikalltag dar zumal sie bei den Patienten substantielles Leid verursachen, oft lebensbedrohlich und sogar tödlich verlaufen und damit eine rasche und auf den speziellen Erreger zugeschnittene Therapie erfordern. Das zunehmende Auftreten von multiresistenten Krankheitskeimen, welches durch die Gabe von Breitband-Antibiotika noch weiter gesteigert wird, ist ein großes Problem in der Behandlung von Infektionserkrankungen, scheint aber unvermeidbar da die herkömmlichen Diagnosemethoden für die Keim- und Resistenzbestimmung bis zu 5 Tage dauern und somit zunächst Breitbandantibiotika eingesetzt werden müssen bevor die Therapie dann speziell auf den Erreger abgestimmt werden kann. Unter den am häufigsten Infektionen verursachenden Bakterien findet sich die Gruppe der MRSA (Methicillin-resistente Staphylococcus aureus Stämme), die gravierende Gesundheitsbeeinträchtigungen verursacht. Aufgrund der genetischen Variabilität von Staphylokokken kann der Verlauf der von ihnen verursachten Infektionen von harmlosen Hautinfektionen bis zur Septikämie (Sepsis, Blutvergiftung) mit hohen Mortalitätsraten reichen. Der Schweregrad der Erkrankung wird durch allfällig vorhandene Antibiotikaresistenzen sowie Virulenzfaktoren beeinflusst. Wie zuvor erwähnt dauern die bislang typischerweise angewandten Diagnostikverfahren sehr lange, da sie zunächst die Kultivierung (Anzucht) des Erregers erfordern. Neue und schnellere Ansätze umfassen PCR (polymerase chain reaction) -basierte Methoden, die aber auch ihre Einschränkungen haben. Oft werden z.B. aufgrund einer beschränkten Möglichkeit des Multiplexen nur eine kleine Auswahl an Erregern oder Resistenzen und keine Virulenzfaktoren detektiert. Zudem erfordert die PCR-Diagnostik eine Reihe von teilweise recht aufwendigen Arbeitsschritten. Nicht zuletzt haben auf DNA basierende Methoden wie die PCR den Nachteil, dass das von Ihnen beispielsweise detektierte Antibiotikaresistenz-Gen nicht notwendigerweise auch eine funktionelle Resistenz zur Folge hat und damit ein falsch positives Ergebnis liefert. Aufgrund dieser zuvor erwähnten Umstände sind Protein-basierte und uneingeschränkt multiplexing-fähige Diagnostik-Methoden hier vorzuziehen, wenngleich Proteinmethoden typischerweise eine geringere Sensitivität und die Notwendigkeit für größere Probenausgangsmengen mit sich bringen. Dementsprechend zielte das vorliegende Forschungsprojekt des AIT- Austrian Institute of Technology und der Universität für Bodenkultur darauf ab, einen neuartigen Antikörper-basierten Microarray für die Detektion von MRSA zu entwickeln, der auf im Rahmen des Projektes selbst generierten single-chain variable fragment (scFv) Fc fusion antibodies für die MRSA-relevanten Virulenzfaktoren Penton-Valentin Leucocidin F (LukF-PV) and S (LukS-PV) und das Antibiotika-Resistenz verursachende Protein Penicillin binding protein 2 (PBP2) beruhte. Der Mikroarray-basierte MRSA Diagnose-Assay konnte dahingehend aufgesetzt und optimiert werden, dass das experimentelle Prozedere einfach gehalten wurde und Detektionslimits von 100-500 pg/ml für die jeweiligen nachzuweisenden Proteine erreicht wurden. Der neue Microarray-Assay wurde auch erfolgreich mit in Serum gespikten klinischen MRSA Isolaten getestet.