Synthetische Biologie mit einem pflanzlichen Retrotransposon

Synthetische Biologie ist eine neue Forschungsrichtung, bei der Veränderungen in einem biologischen System erzielt werden sollen, die in der Natur nicht vorkommen. Wir modifizieren ein mobiles genetisches Element der Familie der Retrotransposons, Tto1, so dass seine Mobilität mit Hilfe einer Chemikalie angeregt werden kann. Retrotransposons werden als Werkzeuge zur Herstellung von Insertionsmutanten verwendet. Gegenwärtige Experimente nutzen natürliche Induktionsbedingungen, insbesondere Gewebekultur-Stress. Insertionsmutanten können daher für jene Pflanzenarten erhalten werden, für die ein effizientes Protokoll zur Regeneration von ganzen Pflanzen aus Gewebekultur-Zellen bereitsteht. Für die meisten Nutzpflanzen ist die Regeneration jedoch sehr aufwändig. Das von uns entwickelte modifizierte Retroelement kommt ohne Gewebekultur-Stress aus und erweitert daher die Anwendung des erfolgreichen Konzepts Insertionsmutagenese. Unter den Nutzpflanzen wurde die Gerste für die erste Anwendung ausgesucht. Gerste ist diploid und von großer Bedeutung in der Landwirtschaft der EU. Die Genom-Sequenzierung wird in Kürze beendet sein. Die weitreichende Nutzung von Insertionsmutanten der Modellpflanze Arabdiopsis lässt erwarten, dass eine ähnliche Kollektion in Gerste zum besseren Verständnis beitragen und als Ausgangsmaterial für Züchtungsbemühungen dienen kann.

Retrotransposons sind DNA-Abschnitte, welche ihre eigene Vermehrung innerhalb eines Genoms bewirken. Retrotransposon-kodierte Enzyme stellen aus der Element-RNA eine vollständige DNA-Kopie des Elements her, die an anderer Stelle in das Wirts-Genom eingefügt wird und dort zu Änderungen der Genaktivität führt. Der Vorgang spielt bei Anpassung von Pflanzen an geänderte Umweltbedingungen ein Rolle, sodass dessen Studium und Manipulation große Nutzeffekte erwarten lässt. Im Projekt wurden Varianten des Tabak-Elements Tto1 in Pflanzen eingebracht, in denen keine weiteren Kopien des Elements vorhanden waren, sodass geänderte Aktivität mit den Variationen in der Sequenz des Elements korreliert werden konnte. In der Modellpflanze Arabidopsis konnte gezeigt werden, dass gewisse Sequenzen der sogenannten Long Terminal Repeat (LTR) Region von Tto1 bei Expression mittels eines Fremdpromotors nicht notwendig sind. Die Verkürzung der LTR Sequenzen soll mithelfen, die Stillegung des Elements durch zelluläre Verteidigungsmechanismen zu erschweren und die Kontrolle über die Element-Aktivität zu verbessern. Viele Varianten von Tto1 konnten in effizienter Weise DNA-Kopien herstellen. Deren Einbau in das Wirtsgenom war jedoch limitierend. Wir untersuchten daher das für den Einbau zuständige Enzym Integrase. Es konnte eine Variante der Integrase identifiziert werden, die evolutionär älter ist als die bisher verwendete Integrase. Vorläufige Untersuchungen legten jedoch nahe, dass beide Varianten etwa gleich hohe Integrase-Aktivität aufweisen. Es wurde damit begonnen, Tto1 in Arabidopsis Mutanten zu testen, welche Mutationen in Verteidigungsmechanismen gegen Genom-Invasion aufweisen. Ziel dieser Versuche war es ebenfalls, die Effizienz der Integration zu erhöhen. Weiters wurden verschiedene Promotoren für die Expression von Tto1 getestet. Als Resultat konnte eine Verbesserung der Expression des Elements erreicht werden. Ein wichtiger Aspekt des Projekts war die Verwendung von Wirten aus dem Bereich der Nutzpflanzen. In internationalen Kollaborationen konnten Tto1 Konstrukte in Gerste und in Karotte getestet werden. Die Analysen dazu sind noch nicht abgeschlossen. Schließlich wurden Sequenzen gesucht, welche für die Verpackung der RNA in sogenannte virusähnliche Partikel zuständig sind. Genaue Kenntnis dieser Sequenzen würde es erlauben, Tto1 als Vehikel für die Vermehrung beliebiger DNA-Sequenzen in einem pflanzlichen Wirt zu verwenden. Die Versuche zu diesem Thema konnten bis zur Herstellung von Testpflanzen geführt werden, die anschließende Analyse des Pflanzenmaterials soll noch folgen.