Aldo-Keto Reduktasen als Biokatalysatoren

Aldo-Keto Reduktasen (AKRs) bilden eine Superfamilie von hauptsächlich NAD(P)-abhängigen Oxidoreduktasen. Eine charakteristische Eigenschaft vieler AKRs ist ihr außerordentlich breites Substratspektrum, welches in in-vitro Aktivitätsstudien gefunden wird. Diese breite Substratakzeptanz ist im Hinblick auf die Produktion chiraler Alkohole ein großer Vorteil und bietet einen guten Anknüpfungspunkt für die Verwendung von AKRs in der Biokatalyse. Aber welche AKR ist für eine bestimmte Biotransfomation gegeignet? Antworten auf diese Frage könnten von einem guten Verständnis der molekularen Basis von Substratspezifitäten in den AKRs kommen und sind relevant hinsichtlich Grundlagenforschung sowie industrieller Anwendbarkeit der AKRs. In diesem Projekt schlagen wir eine Studie der Keton-Substratspezifität sowie der stereochemischen Selektivität der Ketonreduktion der Enzyme Xylose Reduktase aus Candida tenuis (CtXR) und Glycerol Dehydrogenase aus Saccharomyces cerevisiae (Gcy1) vor. Als Basis unserer Untersuchungen werden die bestehenden Kristallstrukturen dieser Enzyme dienen. Ein Ziel des eingereichten Projekts ist die Erweiterung des Spektrums stereoselektiv umgesetzter Ketone von CtXR durch Protein Engineering, auf Basis der Zusammenhänge von Struktur und Substratspezifitäten ausgewählter AKRs. Während CtXR keine C-C Doppelbindungs-Reduktaseaktivität besitzt, akzeptieren einige wenige AKRs sowie kurzkettige Dehydrogenasen/Reduktasen (SDRs), Enoate als Substrat. Anhand des Beispiels dieser verwandten Enzyme wollen wir das aktive Zentrum von CtXR remodellieren um C-C Doppelbindungs-Reduktaseaktivität zu implementieren. Für diese spezielle Aktivität in der AKR Familie 1D ist eine His?Glu Punktmutation in der katalytischen Tetrade der AKRs verantwortlich. In einer His113Glu CtXR Mutante haben wir das aktive Zentrum der AKR 1D Enzyme nachgeahmt. Ebenso haben wir eine SDR-Typ katalytische Triade in CtXR durch eine Tyr51Phe Mutation realisiert. Ziel unserer Arbeit ist die Untersuchung der beiden Mutanten auf C-C Doppelbindungs-Reduktaseaktivität. Aldo-Keto Reduktasen und andere Reduktasen, können in ganzen Zellen oder als isolierte Biokatalysatoren für die Reduktion von Ketonen verwendet werden. In beiden Fällen muß das Coenzym (NADH oder NAD(P)H) in substöchiometrischen Mengen vorliegen, und muß während der Reaktion rezykliert werden. Bäckerhefe- katalysierte Reduktionen haben den Vorteil, daß der Bedarf von NAD(P)H durch den Metabolismus eines Co- substrates gedeckt wird. Leider sind Ganzzellreduktionen oft durch niedrige Stereoselektivitäten gekennzeichnet, welche auf das Vorhandensein von multiplen NADPH-abhängigen Reduktasen mit divergenten enantio- und diastereomeren Bevorzugungen zurückzuführen sind. Um diese Einschränkungen zu überwinden stellen wir eine integrierte Prozessentwicklung mit den Komponenten (i) Struktur-basiertes Enzymengineering, (ii) Zellengineering und (iii) Prozessengineering vor.