Struktur, Funktion und Mechanismus von Desoxyribozymen

Desoxyribozyme, auch DNA Enzyme genannt, sind katalytisch aktive DNAs, die durch in vitro Selektion aus kombinatorischen Nukleinsäurebibliotheken isoliert wurden, in der Natur bisher aber nicht nachgewiesen werden konnten. Einige DNA Enzyme finden bereits praktische Verwendung sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der angewandten Forschung, obwohl über die molekularen Details der komplexen dreidimensionalen Strukturen noch sehr wenig bekannt ist. Dieser Projektantrag befasst sich mit fundamentalen Fragen der DNA Katalyse, und beinhaltet die Charakterisierung von verschiedenen Desoxyribozymen mit einer Reihe von chemischen und biophysikalischen Methoden. Die Methode der DNA Nucleotidanaloginterferenz (DNA nucleotide analog interference mapping, D-NAIM) soll als verlässliches Werkzeug entwickelt werden, mit dem die Bedeutung von bestimmten funktionellen Gruppen gleichzeitig an individuellen Positionen in einzelsträngiger DNA untersucht werden kann. In einem kombinatorischen Ansatz werden modifizierte Desoxyribonucleotide mit chemischen oder enzymatischen Methoden zufällig in DNA Sequenzen eingebaut. Im Vergleich zur separaten Synthese von DNAs mit einzelnen Modifikationen, wird durch die statistische Verteilung der Nucleotidanalogen in der DNA Enzymbibliothek die Anzahl der notwendigen Experimente deutlich verringert. Gleichzeitig mit den Nucleobasenmodifikationen werden Phosphorthioate oder 2`-Hydroxylgruppen eingebaut, die die positionsspezifische Spaltung von Phosphodiesterbindungen erlauben, und somit für die Analyse der Nucleotidinterferenz herangezogen werden können. Durch den Vergleich der Spaltungsmuster von aktiven und inaktiven Desoxyribozymvarianten können die funktionellen Gruppen identifiziert werden, die für die DNA Katalyse erforderlich sind. Die Leistungsfähigkeit der D-NAIM Methode soll anhand der Charakterisierung von RNA-ligierenden Desoxyribozymen illustriert werden. Von besonderem Interesse sind DNA Enzyme, die die positionsspezifische Bildung von 2`,5`-verzweigten RNAs und Lariat-RNAs katalysieren, sowie RNA-Ligase Desoxyribozyme, die linear 3`-5`-verknüpfte RNAs synthetisieren. Die Ergebnisse aus D-NAIM Studien zusammen mit Daten aus lichtinduzierten Vernetzungsexperimenten sollen zu einem mechanistischen Modell für DNA- katalysierte RNA Ligationen führen. Darüber hinaus werden biophysikalische Methoden wie NMR, Fluoreszenz Resonanzenergietransfer (FRET) und vergleichende Gelelektrophorese Experimente eingesetzt, um strukturelle Merkmale des 7S11 Desoxyribozyms im Komplex mit einem 2`,5`-verzweigten RNA Produkt zu untersuchen. Die Einblicke aus diesen Studien sollen zu einem besseren Verständnis des katalytischen Potentials von Nukleinsäuren führen und könnten eventuell für die Konstruktion von verbesserten Biokatalysatoren nützlich sein.