Reaktionsmechanismen und strukturelle Dynamik des Ribosoms

Das Ribosom, ein essentielles und multifunktionelles Partikel, ist für die Proteinsynthese in allen Zellen zuständig. Das Ribosom ist aus zwei Untereinheiten aufgebaut, die wiederum aus ribosomaler RNA (rRNA) und ribosomalen Proteinen zusammengesetzt sind. Ergebnisse jahrelanger biochemischer und neuester kristallographischer Studien zeigten, daß alle ribosomalen Funktionen von den rRNAs bewerkstelligt werden. Trotz detailierter Einsicht in die Struktur des Ribosoms, sind die Mechanismen der beiden Hauptreaktionen der großen ribosomalen Untereinheit (Peptidbindung und Peptid release) auf der molekularen Ebene noch nicht aufgeklärt. Ziel dieses Forchungsprojektes ist es, modifizierte RNA Nukleotide stellenspezifisch in das aktive Zentrum der großen Untereinheit einzubauen, um damit die molekularen Mechanismen der fundamentalen ribosomalen Reaktionen aufzuklären. Da das Ribosom der Hauptangriffspunkt vieler klinisch relevanter Antibiotika ist, ist dessen funktionelles Verständnis von potentieller Bedeutung für die Bekämpfung von Antibiotika Resistenzen und für die Erzeugung neuer anti-mikrobieller Substanzen. Aufgrund der Komplexität des Ribosoms und der größe der rRNAs war der stellen-spezifische Einbau eines einzelnen modifizierten Nukleotids in die ribosomale RNA nicht möglich. Mit der Entwicklung einer neuen Strategie für die in vitro Rekonstitution der großen ribosomalen Untereinheit, kann dieses Problem gelöst werden. Die Idee ist es, eine ribosomale RNA zu konstruieren, deren natürliche Enden kovalent Verbunden sind, wobei neue Endpunkte anderswo im Molekül eingeführt werden (zirkulär permutierte rRNA). Die neuen Enden werden so ausgewählt, daß sie nahe dem aktiven Zentrum sind und werden zum stellen-spezifischen Einbau eines modifizierten Nukleotids innerhalb des Ribosoms verwendet werden. Diese modifizierte RNA wird anschließend zusammen mit den ribosomalen Proteinen zu großen ribosomalen Untereinheiten rekonstituiert. Damit können die funktionellen Auswirkungen dieser Nukleotid Modifikation auf die Peptidbindung und den Peptid release untersucht werden. Zusätzlich kann diese Technik auch zur Aufklärung der ribosomalen Dynamik herangezogen werden. In diesem Fall wird ein photo-reaktives Nukleotid am neu eingeführten Ende der zirkulär permutierten rRNA eingebaut. Photo-crosslink Untersuchungen an Ribosomen in unterschiedlichen funktionellen Stadien können Aufklärung über strukturelle Änderungen des Ribosoms während der Proteinsynthese bringen.