Molekulare Architektur nativer LAMTOR und BORC Komplexe

Lysosomen sind intrazelluläre Signalplattformen, die das Zellwachstum, die Zellteilung und die Zelldifferenzierung steuern. Obwohl wir bereits viel über die molekularen Mechanismen wissen, wie wichtige Nährstoffe wie Aminosäuren, Cholesterin und Glukose erkannt und gemessen werden, gibt es immer noch offene Fragen darüber, wie die Komponenten der Erkennungs- und Signalisierungsmaschinen zusammenarbeiten. Der LAMTOR/Ragulator-Komplex ist ein wichtiger Regulator für die lysosomale mTORC1-, MAPK- und AMPK-Signalgebung. LAMTOR koordiniert auch die Biogenese von Lysosomen über den BORC-Komplex. Wir nehmen an, dass der LAMTOR-Komplex in mehreren funktionell unterschiedlichen Zuständen existiert. Die Existenz verschiedener LAMTOR-Komplexe auf Lysosomen wirft grundlegende Fragen darüber auf, wie anabole und katabole Signalgebung, lysosomale Biogenese und Positionierung auf mechanistischer Ebene koordiniert werden, um zelluläre Homöostase zu gewährleisten. Unser Ziel ist es, alle mit LAMTOR und BORC assoziierten Proteinassoziationen auf intakten Lysosomen unter verschiedenen Wachstumsfaktoren und Ernährungsbedingungen zu identifizieren und Nachweise für direkte undendogeneProtein-Protein-Interaktionen zu erhalten. Dabei werden wirdie Untereinheitstopologie großer Proteinassoziationen bestimmen. Wir werden die Massenspektrometrie mit chemischer Quervernetzung von bestimmten Aminosäuren in Kombination mit anspruchsvoller subzellulärer Fraktionierung einsetzen, um die molekularen Architekturen der verschiedenen LAMTOR- und BORC-Assoziationen in endogenen Mengen und unter verschiedenen physiologischen Bedingungen zu verstehen. Ein einzigartiger Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass natürliche endogene Proteininteraktionen erfasst werden, indem ein chemischer Quervernetzer verwendet wird, der reaktionsfähig gegenüber bestimmten Aminosäureseitenketten ist, die räumlich nahe beieinander liegen. Wir werden eine sehr sensitive Technologie für die Analyse nativer LAMTOR- und BORC-Proteinassoziationen in Knockout-Zellen einsetzen, wobei die Proteinmenge auf natürliche Niveaus wiederhergestellt werden. Dabei werden die ausgeschalteten Gene durch speziell markierte Versionen ersetzt (endogen markierte Knockins). Beide Zellsysteme werden eine wichtige Rolle dabei spielen, strukturelle Veränderungen in Proteinansammlungen unter verschiedenen physiologischen Bedingungen zu erkennen. In einem parallelen Ansatz werden angereicherte Lysosomen zuerst quervernetzt und anschließend die Protein-Komplexe mit hoher Affinität gereinigt, um signalabhängige Umstrukturierungen aufzudecken. Diemolekularen Mechanismen, wie LAMTORmit verschiedenen Sensoren und Signalisierungsproteinen interagiert, insbesondere mit BORC, und wie diese Wechselwirkungen die biologische Entstehung und Funktion der Lysosomen koordinieren, um die Zellhomöostase aufrechtzuerhalten, sind größtenteils unbekannt und daher der Fokus unseres Interesses.