Die molekularen Grundlagen der piRNA-Homöostase

Von kleinen RNAs gesteuerte Gen-Silencing-Wege stellen eine wichge Verteidigungslinie gegen fremde genesche Elemente wie Viren und transponierbare Elemente dar. Der sogenannte PIWI- interacng RNA (piRNA)-pathway sorgt dafür, dass Transposons auf transkriponeller und postranskriponeller Ebene in erischen Keimdrüsen zum Schweigen gebracht werden. Die Identät und Menge der 22-32nt langen piRNAs, die als sequenzspezische Lotsen für Argonaute-Proteine der PIWI-Klasse dienen, sind entscheidend für die Spezität und Wirksamkeit des piRNA-Silencing-Wegs. Während die Faktoren und molekularen Prozesse, die dem piRNA-Weg zugrunde liegen, idenziert wurden, fehlt uns ein quantaves Verständnis darüber, wie diese Prozesse räumlich und zeitlich zusammenwirken, um den zellulären piRNA-Pool zu denieren. Das Ziel dieses Projekts ist die Untersuchung der zellulären Kinek, die der piRNA-Homöostase zugrunde liegt. Um die Prinzipien der piRNA-Homöostase in lebenden Zellen aufzudecken, werden wir SLAMseq an Zellen mit einem funkonellen piRNA-Weg anpassen. SLAMseq ist eine Technologie, die die metabolische Markierung von zellulären RNA-Molekülen mit Nukleinsäurechemie und Sequenzierung der nächsten Generaon kombiniert. Wir werden die zellulären Raten, die molekularen Merkmale und die Regulierung der Transkripon von piRNA-Vorläufern, der piRNA-Verarbeitung und des piRNA-Abbaus mit einer noch nie dagewesenen räumlichen und zeitlichen Auösung entschlüsseln, indem wir biochemische Frakonierung und chemisch-genesche Störung von Schlüsselfaktoren des piRNA-Wegs einsetzen. Die vorgeschlagene Forschung basiert auf der kürzlich entwickelten SLAMseq-Technologie und einer unveröentlichten, immortalisierten Zelllinie, die wir aus Drosophila-Keimbahnstammzellen (GSCs) gewonnen haben. Die GSC-Linie, die wir mit gentechnischen Methoden hergestellt haben, rekapituliert alle bekannten Aspekte der Keimbahn-piRNA-Biologie. Dazu gehören die Expression von drei PIWI-Proteinen, die mit spezischen piRNA-Populaonen beladen sind, die ping-pong piRNA- Biogenese und die Rhino-abhängige piRNA-Cluster-Biologie im Heterochroman. Auf diese Weise können wir zum ersten Mal piRNA-Homöostase-Parameter besmmen, die für verschiedene PIWI- Klassenproteine spezisch sind, und sie mit der Homöostase von microRNA und siRNA in denselben Zellen vergleichen. Anhand der abgeleiteten piRNA-Homöostase-Parameter werden wir die molekularen Grundlagen der adapven Natur des piRNA-Wegs erforschen und untersuchen, ob ein zielabhängiges piRNA-Abbausystem ähnlich dem microRNA-Weg exisert. Das vorgeschlagene Projekt ist eine Zusammenarbeit zwischen den Gruppen von J. Brennecke und S. Ameres und wird die komplementäre technische und konzeponelle Erfahrung beider Gruppen nutzen. Wir werden eine neue Forschungsrichtung an der Schnitstelle von Nukleinsäurechemie, RNA-Stowechsel und Keimbahnbiologie einschlagen, um die molekularen Grundlagen für die eekve Unterdrückung von Transposons aufzuklären; und wir werden unser Verständnis der kineschen Prinzipien der Genexpression und der Heterochroman-Transkripon erweitern.