3D-Nanoskopie der Immunologischen Synapse

In diesem Projekt wollen wir eine der erstaunlichsten Eigenschaften unseres adaptiven Immunsystems erforschen, nämlich dessen einzigartige Empfindlichkeit bei der Unterscheidung von Freund und Feind: unter Umständen reicht schon der Kontakt einer Abwehrzelle (T-Zelle) mit einem einzigen Fremdprotein aus, um eine Abwehrreaktion auszulösen. Diese exquisite Sensitivität ist bis heute nicht vollständig verstanden. Entscheidend für ein besseres Verständnis ist eine genaue Beobachtung der Kommunikation zwischen T-Zellen und jenen Zellen, die Fremdproteine im Körper aufsammeln, in die Lymphknoten wandern und diese den dort vorhandenen T-Zellen bei direkter Berührung präsentieren. Um die Kontaktstelle zwischen den beiden Zelltypen sowie die an der Zell-Kommunikation beteiligten Proteine in ihrer Position und zeitlichem Verhalten genauestens untersuchen zu können, wollen wir drei der präzisesten Messtechniken die uns heutzutage zur Verfügung stehen weiterentwickeln und in einem einzigen Mikroskop vereinen. Wir erwarten, dass dadurch dreidimensionale Positionsbestimmungen im Bereich von bis zu 10 nm Genauigkeit möglich werden, was der Länge von etwa hundert Atomdurchmessern entspricht. Diese Messempfindlichkeit wird es ermöglichen, in bis dato unerreichter Genauigkeit der Kommunikation zwischen beiden Zelltypen folgen zu können sowie vielleicht noch unbekannte Vorgänge aufzudecken.

Unser interdisziplinäres Projekt hat sich zum Ziel gesetzt, mehr über die Antigen-Erkennung durch T-Zellen, spezielle Lymphozyten unseres Immunsystems, herauszufinden. T-Zellen interagieren mit anderen Zellen unseres Körpers (Antigen-präsentierende Zellen), welche kleinste Bruchstücke von Fremdstoffen (z.B. von Viren) den T-Zellen präsentieren. Es ist zurzeit nicht genau geklärt, wie potenziell gefährliche Fremdstoffe von T-Zellen so effektiv erkannt werden können und in weiterer Folge eine Immunantwort des gesamten Körpers auslösen. Wir konnten Ergebnisse in zwei Forschungsfeldern erzielen: Mikroskopie Hier wurden technologische Aspekte der Nanoskopie, d.h. Mikrokopie auf kleinsten Größenskalen, weiterentwickelt. Es wurde ein einfaches Verfahren entwickelt, mit dem sich 3D Positionen von einzelnen Bio-molekülen - zum Beispiel Proteinen in der Zellmembran - im Bereich von nur wenigen Nanometern Genauigkeit bestimmen lassen. In unserem Forschungsprojekt wurde dieses Verfahren eingesetzt, um mehr über die Antigen-Erkennung durch T-Zellen herauszufinden. Weiters konnte unsere Forschung die Frage beantworten, ob eine gemeinhin etablierte Methode (Interferenz-Reflexionsmikroskopie, IRM) verwendet werden kann, um die Abstände einer Zellmembran vom Mikroskop-Deckglas zuverlässig zu bestimmen. Wir konnten zeigen, das IRM meist zuverlässig funktioniert, aber in manchen Bereichen der Zellmembran gravierende Fehler liefert. Biologie Im Hinblick auf die biologischen Aspekte konnte unsere Forschung im Wesentlichen folgende Fragen beantworten: 1) Existieren "Nanocluster" von T-Zellen Rezeptoren (TCR) tatsächlich? Wir konnten nachweisen, dass die bisher beschriebenen TCR Nano-Cluster in der Zellmembran von inaktiven T-Zellen auf Artefakte der Bildgebung und der Datenanalyse zurückgeführt werden können. Manche Farbstoff-Moleküle werden mehrfach gemessen und gezählt, und gaukeln so lokal höhere TCR-Dichten - also TCR-Cluster - vor. 2) Was sind physikalische Gründe für die Beobachtung von TCR - Mikroclustern? Die Beobachtung von Mikro-Clustern bei der Aktivierung von T-Zellen könnte ebenfalls zum Teil von Artefakten der Bildgebung herrühren: Da sich diese Moleküle näher am Deckglas befinden, erscheinen Sie durch eine erhöhte Licht-Einkopplung ins Deckglas besonders hell, was wiederum eine Anreicherung von Molekülen suggerieren kann. Wir konnten zeigen, dass dieser "Verstärkungseffekt" nur eine untergeordnete Rolle spielt und tatsächlich molekulare Anreicherung, d.h. die Formierung von Mikro-Clustern, stattfindet. 3) Ist der Abstand zwischen den Membranen von T-Zelle und Antigen-präsentierender Zelle zu klein für das Protein CD45? Eine etablierte Theorie für die Triggerung von T-Zellen involviert das recht große Molekül CD45. Darum ist es wichtig zu wissen, ob diese Molekül überhaupt in den schmalen Spalt zwischen den beiden Zellmembranen hineinpasst. Unsere hochgenauen Messungen deuten darauf hin, dass der Membranabstand tatsächlich zu klein für CD45 sein könnte, sowohl für aktive als auch für inaktive T-Zellen. Dies erlaubt nun die Eingrenzung der möglichen Theorien für die T-Zell Aktivierung.