Wechselwirkungsoberflächen des Tumor-Suppressor-Proteins NF2

Verlust oder Inaktivierung des Tumorsuppressor-Proteins NF2 trägt zu einer Vielzahl menschlicher Krebserkrankungen bei. Normalerweise unterdrückt NF2 das Zellwachstum als Reaktion auf Zell-Zell- Kontakte durch Modulation zellulärer Signaltransduktionswege. Diese Tumorsuppressor-Funktion ist Isoform-spezifisch und hängt von der subzellulären Lokalisierung, der Interaktion mit anderen Proteinen und von posttranslationalen Modifizierungen von NF2 ab. Diese Merkmale sind untrennbar mit der Proteinstruktur von NF2 verbunden, jedoch ist die tatsächliche Beziehung zwischen der Struktur und seiner Aktivität als Tumorsuppressor nicht gut verstanden. Welche Konformation, welche Isoform, welche Modifikationen und welche NF2 Interaktionspartner eigentlich essentiell für die Tumorsuppressor-Funktion des Proteins sind, sind offene Fragen. Wir werden neue Modifizierungs- und Isoform-abhängige Protein-Wechselwirkungen mit NF2 untersuchen, sowie NF2 intra- und inter Bindungen sehr genau Aminosäurebaustein für Baustein betrachten. Wir werden systematisch NF2 Interaktionsflächen abbilden und jene Aminosäuren in NF2 tauschen, die selektiv NF2 Wechselwirkungen und NF2 Konformation stören. Diese Mutanten definieren somit genetisch die unterschiedlichen NF2 Funktionszustände, die dann für das Wachstum bei Krebs in der Zellkultur analysiert und genau charakterisiert werden. Dieser Protein Interaktion Ansatz zur Untersuchung von NF2 wird die Struktur-Funktions-Beziehungen besser definieren, wird klären welche Isoform- und Modifizierungs- abhängigen Effekte in der zellulären Signaltransduktion von NF2 essentiell für die Tumorsuppressoraktivität sind. Das Projekt wird methodisch durch ein neu entwickelten Reverse-Y2H System ermöglicht, das sich der Second Generation-Sequenzierungs-Technologie bedient. Wir werden auch einen kürzlich publizierten Microarray-programmierten Oligonukleotidsynthese Ansatz anwenden und umfassende Bibliotheken von Einzelpunktmutationen darzustellen, in denen jede Aminosäure in NF2 gegen mehrere andere Aminosäuren ausgetauscht werden wird. Mit dem Reverse-Y2H System selektieren wir sehr effizient jene Proteinvarianten, die selektiv eine Protein-Wechselwirkung stören. Damit finden wir jene Aminosäuren in NF2 die essentiell für NF2 intra-, inter- und PTM-abhängigen Bindungen mit anderen Protein- Interaktionspartner sind. Durch moderne Sequenzierungsmethoden werden kontinuierlich neue somatische Mutationen in Patientenproben in sehr großer Zahl dargestellt, und wir haben keine effizienten Methoden um systematisch ihre funktionellen Auswirkungen zu beurteilen. Es ist daher sicher eine wichtige Frage der Zukunft die große Zahl von genotypischen Variationen mechanistisch zu beschreiben. In diesem Projekt zeigen wir einen Ansatz, der als allgemeine Strategie erweiterbar ist um systematisch potentielle funktionelle Effekte von Mutationen zu kategorisieren.

Das Protein Neurofibromin 2 (NF2) ist ein wichtiger Tumorsuppressor und zellulärer Kontaktinhibitor. Homozygote Mutationen oder Deletion des NF2-Gens führt häufig zur Tumorbildung. Die hohe Sequenzhomologie zur Ezrin Radixin Moesin (ERM) Proteinfamilie, die keine Funktion im Zellwachstum hat, lässt Rückschlüsse auf eine Regulation durch intramolekulare Interaktionen zu. Die Funktion der ERM-Proteine wird durch eine Konformationsöffnung oder -schließung kontrolliert, die durch intramolekulare Wechselwirkungen gesteuert wird. Wie die verschiedenen Konformationszustände von NF2 mit der Tumorsuppressorfunktion des Proteins zusammenhängen, ist jedoch nach wie vor nicht klar. Sogenannte "deep mutational scanning" Ansätze, bei denen jede Aminosäure eines Proteins durch eine andere ersetzt wird, bieten die Möglichkeit, genetische Varianten mit funktionellen Auswirkungen auf das Protein in einem umfassenden Ansatz zu identifizieren. Durch die Kopplung des Systems mit einem auf Hefe basierenden Proteininteraktions-Readout und mit konformationsabhängigen Bindungspartnern werden NF2-Mutationen, die sich direkt auf spezifische Proteininteraktionen auswirken, und Proteinregionen, die für Konformationsänderungen empfindlich sind, identifiziert. Mit diesem Ansatz zeigten wir, dass Mutationen, die die Konformation von NF2 verändern, in struktureller Nähe in definierten Proteindomänen gefunden werden können. Eine Untergruppe von 53 NF2-Mutationen wurde in jeder der beiden NF2-Isoformen generiert und einzeln in Protein-Interaktions-Assays getestet. Es wurden 15 interaktionsverändernde einzelne Aminosäuremutationen charakterisiert, die die Proteinfunktion im Zusammenhang mit der Expression, der zellulären Lokalisierung und der Proliferation in Säugetierzelllinien beeinflussen. Die 3H-Region von NF2 scheint für NF2-NF2-Wechselwirkungen entscheidend zu sein. Die N-terminale FERM-Domäne erwies sich als wichtige regulatorische Einheit des Tumorsuppressorproteins. Mutationen in der FERM-F3-Subdomäne führten zu Konformationsänderungen und beeinträchtigten die Proteininteraktionen und die Proteinfunktion. Mutanten der F2/F3-Subdomäne modulierten die Zellproliferation und eine Variante beeinträchtigt die zelluläre Lokalisierung von NF2. Unsere funktionelle Charakterisierung zeigte den großen Einfluss von Konformationsänderungen innerhalb der FERM F3-Subdomäne auf die Aktivität des Tumorsuppressors NF2.