Tight junctions im Hühner Darm und Campylobacter Infektion

Eine grosse Anzahl von Masthühnern sind mit Campylobacter infiziert und Geflügelprodukte stellen die wichtigste Quelle für die menschliche Infektion dar. Weltweit nehmen die Infektionen bei Menschen zu, mit erheblichen Konsequenzen für die menschl. Gesundheit und die Ökonomie. Im Gegensatz zur generellen Annahme, dass C. jeuni beim Geflügel nur ein Kommensale ist haben jüngste Studien gezeigt, dass einige Isolate einen negativen Einfluss auf die Gesundheit und das Wohlergehen der Tiere haben. Obwohl Campylobacter hauptsächlich das Zäkum kolonisiert, beeinflußt die Infektion auch zahlreiche Funktionen im Dünndarm. Wir konnten zeigen, dass eine Campylobacterinfektion verschiedene Einflüße auf die Darmgesundheit hat. Von Bedeutung ist die Störung der intestinalen Barriere durch C. jejuni, was zu einer höheren Permeabilität führt. Dies bedingt auch eine verstärkte Besiedelung interner Organe, was nicht nur auf Campylobacter begrenzt ist. Diese Studien müssen nun vertieft werden i) um die funktionalen Einflüße einer Campylobacterinfektion auf den Darm aufzuklären und ii) das Wissen auf Campylobacterstämme mit einem unterschiedlichen Infektionsprofil auszudehnen. Die Kolonisierung des Darmes mit Campylobacter, was auch zur Translokation und zur Dissemination des Bakteriums in interne Organe führt, hat einen wesentlichen Einfluß auf die Tight Junction Proteine des Hühnerdarmes, mithin die hauptsächliche Hypothese des Projektes. Die durchzuführenden Arbeiten fokussieren sich somit auf diese Tight Junction Proteine und unter Benutzung unterschiedlicher Campylobacterstämme, welche sich durch das Potential interne Organe zu besiedeln, unterscheiden. In vivo Studien werden kombiniert mit verschiedenen Labortechniken, wie Immunohistochemie, Elektronen- und Zwei- Photonenmikroskopie sowie Western Blot und Expressionsanalysen, um die Struktur der Darmbarriere zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Infektion zu untersuchen. Die Grundlagen zu ermitteln, wie C. jejuni vom Darm aus interne Organe besiedelt, ist ein wesentliches Element in der Infektionsbiologie des Bakteriums. Das Projekt wird auch als Model fungieren, wie gram-negative Pathogene Darmfunktion und gesundheit beeinflussen. Die Ergebnisse werden zeigen, wie Campylobacter im Darm persistiert und die internen Organe besiedelt. Das vorgeschlagene Projekt beinhaltet einen neuen Ansatz um die Interaktion von Campylobacter mit seinem ursächlichen Wirt zu untersuchen.

Das TJ-Protein Tricellulin (MD2) wurde bislang bei Hühnern noch nicht erkannt. Studien an anderen Arten haben jedoch gezeigt, dass MD2 eine wichtige Rolle bei der Abdichtung der trizellulären Verbindungen dreier benachbarter Zellen spielt und in gewisser Weise entscheidend für die TJ-Barrieren gegen den Durchgang makromolekularer Zellen ist. Die quantitative Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) bleibt als genaue, schnelle, empfindliche und kostengünstige Methode eine der genomischen Methoden der Wahl für die Quantifizierung spezifischer mRNA-Sequenzen. RT-qPCR kann entweder mit einem unspezifischen DNA-Bindungsfarbstoff wie SYBR-Green oder unter Verwendung einer fluoreszenzmarkierten internen DNA-Sonde durchgeführt werden. Interne DNA-Sonden erkennen nur eine zielspezifische DNA-Sequenz, was die Spezifität in Gegenwart anderer unspezifischer PCR-Produkte oder Primer-Dimere erhöht. In diesem Projekt wurde erstmals die Entwicklung einer sondenbasierten Rt-PCR-Methode zur Charakterisierung der Tight Junction-Proteine (TJ) von Hühnern im Zusammenhang mit einer Campylobacter-Infektion etabliert. Es wurden sequenzspezifische Sonden für verschiedene TJ-Gene (Claudin 1, 3, 5, 7, 10, 19, Zonula occludens 1 (ZO1), Occludin (OCLN) und Tricellulin (MD2) entwickelt und sondenbasierte RT-qPCRs entwickelt . Claudin (CLDN) 1, 5, ZO1 und CLDN 3, 7, MD2 wurden in Multiplex-RTqPCRs eingeschlossen, um die Anzahl separater Reaktionen zu minimieren und eine robuste Prüfung vieler Proben zu ermöglichen. Alle RT-qPCRs wurden für Hühner-Jejunum- und Blinddarmproben standardisiert, was einen spezifischen Nachweis und eine Quantifizierung der Genexpression ermöglichte. Campylobacter ist weltweit die häufigste Ursache bakterieller, durch Lebensmittel übertragener Erkrankungen. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass C. jejuni schädliche Auswirkungen auf die Darmgesundheit von Hühnern hat, und wir haben gezeigt, dass eine Infektion mit C. jejuni bei Hühnern mit erheblichen Veränderungen der Darmbarriere einhergeht, die zu Darmstörungen führen. Darüber hinaus deuten die Ergebnisse darauf hin, dass C. jejuni die parazelluläre Permeabilität des Darms verstärkt, was Auswirkungen auf die Verlagerung von Bakterien durch die Schleimhaut und in Richtung innerer Organe hat. Wir analysierten die Struktur von Tight Junctions auch mittels Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie, immunhistochemisch mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie und quantifizierten sie in Immunblots. Zur Untersuchung der Dimensionsverteilung von Tight-Junction-Proteinen zwischen Zellen wurde die Gefrierbruch-Replika-Markierungstechnik verwendet. Insgesamt haben wir die Struktur von Tight Junctions und die Regulation der Barrierenbildung unter physiologischen und pathologischen Bedingungen bei Hühnern charakterisiert.