FT-ICR MS Studien von RNA-Protein/RNA-Ligand Interaktionen

Wechselwirkungen zwischen Ribonukleinsäuren (RNA) und Proteinen oder anderen Liganden wie zum Beispiel Metaboliten spielen in vielen biologischen Prozessen wie der Biosynthese von Proteinen oder Infektionen durch RNA- Viren eine wichtige Rolle. Für ein grundlegendes Verständnis dieser wichtigen Wechselwirkungen werden RNA-Protein undRNA-Ligand Komplexe üblicherweisemitKernspinresonanz-Spektroskopie (NMR)oder Kristallstrukturanalyse untersucht, wofür allerdings relativ viel Probenmaterial benötigt wird. Ausserdem kann die bei der NMR Spektroskopie erforderliche Isotopenmarkierung der Probe aufwändig sein, und eine Kristallstrukturanalyse ist nur dann möglich, wenn ein Komplex geeignete Kristalle ausbildet. In unseren früheren Arbeiten zu Proteinen, Literaturdaten und vorbereitenden Studien zu diesem Projekt haben wir starke Hinweise darauf gefunden, dass in der Gasphasen-Umgebung eines Massenspektrometers die elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen Bindungspartnern stärker als ihre kovalenten Bindungen seinkönnen.Zufälligerweise sindelektrostatische Wechselwirkungen wesentliche Elemente von RNA-Protein Bindungen und kommen auch oft in RNA-Ligand Komplexen vor. In diesem Projekt werden wir diese ungewöhnlich starken Wechselwirkungen im Detail untersuchen undbeiderEntwicklungeiner neuen Massenspektrometrie (MS) Methode zur Detektion von RNA-Protein und RNA- Ligand Komplexen sowie der Charakterisierung ihrer Wechselwirkungsflächen einsetzen.Dieser Ansatz ist komplementärzu NMRSpektroskopie, Kristallstrukturanalyse und anderen biophysikalischen oder biochemischen Methoden, bietet besondere Vorteile wie hohe Empfindlichkeit und liefert gleichzeitig umfangreiche Informationen zur Sequenz der Bindungspartner.

Ziel des Forschungsprojekts "FT-ICR MS Studien von RNA-Protein/RNA-Ligand Interaktionen" war es, ein grundlegendes Verständnis der elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen Ribonukleinsäuren (RNA) und Proteinen oder anderen Liganden in der Gasphase zu erlangen und damit eine solide Grundlage für die Entwicklung einer Top-Down Methode mit nativer Elektrospray-Ionisation (ESI) Massenspektrometrie (MS) zum Nachweis von RNA-Protein Komplexen und zur Charakterisierung von Bindungsstellen zu erarbeiten. Zu diesem Zweck untersuchten wir (1) die Stabilität nativer RNA-Protein und RNA-Ligand Komplexe in der Gasphase, (2) die Konkurrenz zwischen RNA-Rückgratspaltung und nicht-kovalenter Bindungsdissoziation bei unterschiedlichen Aktivierungsenergien und (3) die Bindung kleiner Moleküle als Modelle für funktionelle Gruppen, Teile oder Segmente von Proteinen an RNA. Wir fanden heraus, dass der Peptid- oder Ligandendissoziation in der Gasphase generell ein intermolekularer Protonentransfer vom Peptid oder Liganden auf die RNA vorausging - ein Prozess, der bei sehr hoher (hohe Protonenaffinität der RNA-Anionen) oder sehr niedriger (hohe Anzahl verfügbarer H+) negativer Nettoladung der Komplexe begünstigt wurde. Bei mittlerer Nettoladung (0.2 - 0.4 Ladungen/nt) bleiben die Wechselwirkungen zwischen Ligand und RNA während CAD erhalten, sofern ihre Anzahl ausreichend hoch ist, was typischerweise bei Peptiden und Liganden wie Aminoglykosiden der Fall ist. Darüber hinaus haben wir in Bezug auf Nettoladung und Aktivierungsenergie das experimentelle Fenster bestimmt, das eine vollständige Sequenzabdeckung durch c und y Fragmente ermöglicht und gleichzeitig die intermolekularen Wechselwirkungen bewahrt. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse konnten wir die native top-down ESI MS für den Nachweis von RNA-Protein und RNA-Ligand Komplexen und die Charakterisierung von Bindungsstellen unter Verwendung der kollisionsaktivierten Dissoziation mit niedriger Energie entwickeln, und diesen Ansatz in Studien zur Bindung von Transaktivierungspeptiden (tat) an Transaktivierungs-RNA (TAR) und Rev-Peptiden an Rev-Response-Element-RNA (RRE) aus dem Humanen Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) sowie zur Bindung von Aminoglykosiden an ein Riboswitch-Aptamer einsetzen.