Biosynthese von Wurm N-Glykoproteinen in Insektenzellen

Haemonchus contortus ist einer der bedeutendsten parasitären Würmer, der Schafe und Ziegen befällt und dadurch wirtschaftliche Verluste im Wiederkäuersektor verursacht und folglich die Lebensmittelsicherheit bedroht. Im Vergleich zur Verwendung von Anthelminthika, die eine Resistenz gegen parasitäre Nematoden verursachen können, stellt die Impfung einen nachhaltigen und wirksamen Ansatz dar. Die Impfung mit einer Mischung aus nativen Haemonchus-Glykoproteinen (H11- Antigene) zeigte einen wirksamen Schutz bei Lämmern. Versuche, diese Antigene rekombinant in unterschiedlichen Expressionswirten zu züchten und sie als Impfstoffe zu verwenden, zeigten entweder einen geringen oder gar keinen Schutz bei Tierversuchen. Da bekannt ist, dass native H11-Antigene auf der Oberfläche zusätzliche Zucker-Modifizierungen tragen (als Glykosylierung bezeichnet), was bei der biologischen Funktion von Antigenen eine bedeutende Rolle spielt, ist die Erforschung einer Möglichkeit zur Nachahmung dieser natürlichen Zucker- Modifizierungen für die Produktion von wirksamen Antigenen erforderlich. Die Zuckerstrukturen der nativen H11-Antigenen besitzen bis zu drei Fukosereste, die durch drei Fukosyltransferasen synthetisiert werden. FUT-1 und FUT-8 sind die Fukosyltransferasen, die nur den innersten GlcNAc-Rest mit Fukose jeweils in der 3- Position und 6-Position modifizieren. In diesem Projektantrag stelle ich die Hypothese auf, dass eine Golgi a1,6-Mannosidase für die Fukosylierung des zweiten GlcNAc-Restes durch eine dritte Fukosyltransferase (FUT-6), erforderlich ist. Eine gewöhnliche Insektenzellenlinie (Hi5) ist der ideale Wirt für Glycoengineering, um wirksame rekombinante Wurmantigene, die mit authentischem Zucker modifiziert wurden, zu produzieren. Die Infektion von Wirtszellen mit rekombinanten Baculovirus, der Glykoenzyme von Caenorhabditis elegans codiert, wird verwendet um die Zucker auf den Wurmantigenen wirksam umzubilden. Die biologische Rolle der C. elegans Glykoenzyme wird durch die Erforschung der Zuckerstrukturen von speziellen Mutanten mittels HPLC und Massenspektrometer erforscht. Rekombinanter Baculovirus mit zwei C. elegans Glykoenzymen und DNA- Sequenzen von Haemonchus H11 (Reporterproteine) wird zur Produktion von H11- Antigenen in Hi5-Insektenzellen herangezogen. Zusätzlich zu den Protein- Sequenzen und Peptidaseaktivitäten werden die biochemischen Eigenschaften der glycoengineerten H11-Antigenen mit Hauptaugenmerk auf die Zuckermodifikationen und andere potentielle Proteinmodifikationen beurteilt. Dies ist möglicherweise der erste Versuch in Insektenzellen Wurmantigene, die mit authentischem Zucker modifiziert wurden, herzustellen. Es wird erwartet, dass die glycoengineerten H11- Antigene die nativen H11-Antigene besser nachahmen und sich daher besser als Veterinärimpfstoff zum Schutz von Wiederkäuern vor einer Haemonchus-Infektion eignen.