tRNA Molekülen: Von enzymatischen Komplexen zu Erkrankungen

Der letzte Schritt auf dem Weg, genetische Information, welche in der chromosomalen DNA verschlüsselt ist, in Proteine zu übertragen, wird als Translation bezeichnet. Die grundlegenden Moleküle dieses Schrittes sind die sogenannten Transfer-RNAs (tRNAs), die zum Decodieren dieser Informationen dienen. Einige von ihnen beinhalten kurze zwischenliegende Sequenzen, die eliminiert werden müssen, bevor tRNAs voll funktionsfähig werden können. Dies wird in einem Prozess vollzogen, dem pre-tRNA Spleißen, in dem diese Sequenzen zuvor durch einen Enzymkomplex , der pre-tRNA-Spleißendonuklease, entfernt werden, und die restlichen Sequenzen werden anschließend durch das enzymatische Einwirken einer tRNA-Ligase zusammengefügt (tRNA Ligation). In diesem Forschungsantrag werden wir untersuchen, ob die pre-tRNA-Spleißmaschinerie andere RNA Moleküle als tRNAs reguliert und die präzise Funktion jeder Proteinuntereinheit des humanen tRNA-Ligase-Komplexes durch dessen Rekonstitution mittels rekombinanter Proteine aufzeigen. Wir wollen auch zum Verständnis von Krankheitsmechanismen durch die dreidimensionale Strukturanalyse des humanen pre-tRNA-Spleißendonuclease-Komplexes mit Mutationen, die in Patienten vorkommen, welche an einer Gehirnerkrankung, genannt pontocerebellären Hypoplasie, leiden, beitragen. Dies soll ebenfalls durch die Strukturaufklärung des menschlichen tRNA-Ligase-Komplexes erreicht werden, um das strukturelle Modellieren von kleinen inhibitorischen Molekülen mit therapeutischen Potenzial zu ermöglichen. Unsere aktuellen Studien zeigen weiters auf, daß pre-tRNA-Spleißen, insbesondere der Ligationsschritt, durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS), reguliert wird. Falls ROS in höherer Konzentration in der Zelle vorhanden ist, führt dies zu biologischen Ungleichgewichten und toxische Effekten (oxidativer Stress). Um den zugrundeliegenden Mechanismus aufzuklären, werden wir eine analytische chemische Methode anwenden, die sogenannte Massenspektrometrie, um wichtige chemische Modifikationen an dem tRNA-Ligase-Komplex zu identifizieren, die dessen Aktivität beeinflussen, und unsere Kollaboratoren in Japan werden weiters testen, ob dieses Phänomen auch in Archaea und Hefe erfolgt. Dieses multidisziplinäre Projekt stützt sich auf eine intensive Zusammenarbeit mit anerkannten Strukturbiologen und Experten auf dem Gebiet des pre-tRNA-Prozessierens in Hefe und Archaea.

Genetische Information wird von Genen in unserer genomischen DNA über Boten- (Messenger)-RNA-Moleküle (mRNA) an Proteine, den Arbeitspferden der Zelle, übertragen. Es gibt jedoch auch andere RNA-Moleküle außer mRNAs, die ihre eigenen und unabhängigen Funktionen haben. Unter diesen gibt es die Transfer-RNAs (tRNAs), eine sehr häufig vorkommende Klasse von RNAs, die für die Translation von mRNAs in Proteine essenziell sind. tRNAs durchlaufen wie die meisten zellulären RNAs eine Reihe von Modifikationen und Umwandlungen, bevor sie biologisch aktiv werden. Mein Labor konzentriert sich auf eine bestimmte Art der Umwandlung, das sogenannte "Spleißen", bei dem bestimmte RNA-Abschnitte (Introns) entfernt und die verbleibenden RNA-Stücke (Exons) durch spezielle Enzyme miteinander verbunden werden. In dem Projekt, das wir gerade zusammen mit Dr. Simon Trowitzsch (Universität Frankfurt) und Prof. Martin Jinek (Universität Zürich) durchgeführt haben, haben wir zum ersten Mal die dreidimensionale Struktur der beiden Enzyme enthüllt, die das Spleißen von tRNA-Molekülen ausführen: der tRNA-Spleißendonuklease (TSEN) -Komplex, der das Intron in Vorläufer-tRNAs entfernt, und das Enzym, das die verbleibenden Exons miteinander verbindet, der tRNA-Ligasekomplex. Trotz des großen Projektfortschritts ist es uns leider nicht gelungen, hochauflösende Strukturen der gesamten enzymatischen Komplexe zu erhalten, da diese Enzyme nicht leicht zu "kristallisieren" sind. Sie werden nicht starr genug, um einen Kristall zu bilden, und daher ist die Struktur nur sehr schwer zu bestimmen. Parallel zu den Strukturbestimmungen haben wir jedoch große Fortschritte bezüglich der biochemischen Analyse dieser Enzyme gemacht. Insbesondere haben wir die Funktion von TSEN-Komplexen mit Mutationen charakterisiert, die zu einer seltenen neurologischen Erkrankung führen, die als pontozerebelläre Hypoplasie (PCH) bekannt ist. Warum Mutationen in TSEN PCH verursachen, ist jedoch weitgehend unbekannt. Wir haben auch einen besonderen Regulationsmechanismus des tRNA-Ligasekomplexes untersucht, des Enzyms, das die beiden tRNA-Exons miteinander verbindet, sobald das Intron entfernt wurde. Überraschenderweise ist der tRNA-Ligasekomplex empfindlich gegenüber Molekülen, die unter oxidativen Bedingungen entstehen. Eines dieser Moleküle ist Wasserstoffperoxid (H2O2). Wir identifizierten ein Enzym namens PYROXD1, welches mit der tRNA-Ligase koevolvierte, um diese wiederum vor Oxidation zu schützen. In einem Artikel, den wir gerade in der Zeitschrift "Molecular Cell" veröffentlicht haben, haben wir diesen "Beschützer" sowohl auf biochemischer als auch auf struktureller Ebene sehr detailliert untersucht und den sehr neuartigen Schutzmechanismus aufgeklärt. Unsere Studien zur Struktur und biochemischen Analyse des TSEN-Komplexes und des tRNA-Ligasekomplexes sind abgeschlossen und werden in Kürze zur Publikation eingereicht.