Die proteinmodifizierende Prolylhydroxylase von Tabak

Die dem bekannten Tabak verwandte Art Nicotiana benthamiana wurde zu einer ernstzunehmenden Möglichkeit für die Produktion pharmazeutischer Protein entwickelt. Prolin ist eine Aminosäure, die in einigen Proteinen durch Oxidation modifiziert wird. Das dabei entstehende Hydroxyprolin ist ein Bestandteil von Knorpelproteinen wie Kollegen, kommt aber auch in vielen interzellulären Pflanzenproteinen vor. In Pflanzen kann das Hydroxyprolin weiter modifiziert werden durch das Anhängen des Zuckers Arabinose, den es in Säugetieren nicht gibt. Beide Modifikationen findet man in Beifuß- und Ragweed-Pollen, wo sie vermutlich bei Allergikern eine gewisse Rolle bei der Bindung von IgE spielen. Da Pflanzen ihre grundsätzliche Eignung als Expressionssysteme für Biopharmaka wie Antikörper bewiesen haben, sehen wir es als geboten, den Versuch zu unternehmen potentiell gefährliche Modifikationen zu unterbinden. Dem Antragsteller und seinen Kollegen ist es bereits gelungen die bedeutendste Modifikation, i.e. eine bestimmte protein-gebundene Kohlenhydratstruktur, zu eliminieren. Die entsprechende Tabak-Linie wurde bereits für die Produktion des bekannten anti-Ebola Antikörpers ZMAPP eingesetzt. Mit der Prolin-Oxidation soll nun der verbleibende problematische Punkt bei der Verwendung von Pflanzen ins Visier genommen werden. Die dafür verantwortlichen Enzyme in Nicotiana benthamiana sollen identifiziert werden und Pflanzenlinien, in denen diese Gene unterdrückt sind, sollen generiert werden. Proteine, welche in Wildtyp-Pflanzen Ziel der Oxidation sind, werden in den neuen Pflanzenlinien exprimiert und analysiert werden um zu zeigen, inwieweit diese Bemühungen zu sicheren und gut verträglichen Pharmazeutika führen können. Da die Hydroxyproline der Ankerpunkt für die pflanzenspezifische Anheftung von Arabinosen sind, entsteht aus den hier angewandten Methoden und Materialien gleich auch die Möglichkeit die Bildung und Struktur des noch sehr rätselhaften Arabinose-Epitopes und seine Rolle für Allergiker zu untersuchen.

Pflanzen stellen ein neues Produktionssystem für pharmazeutische Proteine dar wie z.B. Antikörper. Für manche Proteine können Pflanzen im Hinblick auf Kosten und Produktqualität geeigneter sein als Bakterien, Hefen oder tierische Zellen. Allerdings führen sie manche posttranslationalen Modifikationen etwas anders aus als Menschen. Was die Asparagin-gebundenen Kohlenhydrate betrifft, hat man dieses Problem für das System Tabak (genauer: Nicotiana benthamiana) bereits weitgehend gelöst. Ein wunder Punkt für manche Zielproteine kann die Oxidation von Prolin zu Hydroxyprolin sein, welche obendrein dann noch durch Anhängen von Arabinose begleitet sein kann. Diese Modifikationen sind unerwünscht. In einem sehr speziellen System, das mit Moos-Zellen arbeitet, wurde ein einziges Enzym (eine sogenannte Prolyl-Oxidase) als dafür maßgeblich identifiziert. Im vorliegenden Projekt wurde erstmals die Prolin-Oxidation in einer Gefäßpflanze näher betrachtet. Als Zielproteine wurden Erythropoietin (kurz EPO) und die bei der Abwehr respiratorischer Pathogene (Stichwort SARS-CoV 2) Antikörperklasse IgA1 ausgewählt. Es zeigte sich, daß in der Tabak-Variante mehrere homologe Enzyme für die Modifikation der Zielproteine zuständig sind. Die Unterdrückung der Gen-Expression von zwei der Enzyme führte zwar zu einer Reduktion der unerwünschten Oxidation, jedoch noch nicht im erwünschten Ausmaß. Dies sollte jedoch in Folge auf Basis der Ergebnisse des vorliegenden Projektes durch Anwendung der Crisp-Cas Technologie in einem schon laufenden Folge-Projekt möglich sein.