Rolle von SRP14AS1 für Stress Granules und Ewing Sarkom

Das Ewing Sarkom ist der zweithäufigste Knochentumor bei Kindern und Jugendlichen Europäischer Abstammung, tritt jedoch bei Afrikanern nur sehr selten auf. Die molekulare Grundlage für diesen Unterschied ist unbekannt. In diesem Projekt gehen wir der Hypothese nach, dass natürliche genetische Variationen in der Regulation von Bestandteilen intrazellulärer Körperchen, welche sich unter zellulärem Stress bilden, für Ewing Sarkom prädisponieren. Das Ewing Sarkom zeichnet sich durch eine chromosomale Umlagerung aus, welche zur Bildung eines entarteten genregulatorischen Proteins führt, das die Krankheit antreibt. Kürzlich wurden Variationen in drei genomischen Regionen beschrieben, die spezifisch mit dem Auftreten der Erkrankung assoziiert sind, und sich zwischen Europäern und Afrikanern unterscheiden. Unsere vorläufigen Resultate ergaben, dass zwei dieser Regionen die Regulation von Bestandteilen zytoplasmatischer Foci betreffen, welche sich als früheste Antwort auf zellulären Stress bilden, die sogenannten Stress Granules. Wir haben zuvor die funktionelle Relevanz der Ewing Sarkom Anfälligkeitsregion auf dem Chromosom 15q15 untersucht. Wir fanden, dass diese Region vom Ewing Sarkom Onkogen gebunden wird und Eigenschaften eines genregulatorischen Elementes zeigt, welches die Expression einer langen, nicht- kodierenden RNA, SRP14-AS1, kontrolliert. Experimentelle Modulation der SRP14-AS1 Expression oder Deletion des identifizierten genregulatorischen Elementes führte zu einer signifikanten Verminderung der Fähigkeit von Ewing Sarkom Zellen Stress Granules unter Stress zu bilden. Dies erinnert an die sehr ähnlichen Konsequenzen der Verminderung der Expression von TDP-43, eines Bestandteils der Stress Granules, dessen Regulation ebenfalls ein Ziel Ewing Sarkom assoziierter genetischer Variation ist. Parallel beobachteten wir eine drastische Verminderung der Fähigkeit von Ewing Sarkom Zellen unter Oberflächen unabhängigen Kulturbedingungen zu wachsen, einer Bedingung, die der des Tumorwachstums in vivo sehr nahe kommt. Vorläufige Resultate zeigen, dass SRP14-AS1 an das Protein SRP14 bindet, welches ebenso eine Komponente von Stress Granules darstellt. Diese Ergebnisse legen daher eine funktionelle Verbindung zweier Genprodukte nahe, die von zwei unabhängigen genomischen Ewing Sarkom Prädispositionsregionen kontrolliert werden. Deshalb wird dieses Projekt die Rolle von Stress Granules in der Pathogenese des Ewing Sarkoms und die Mechanismen, durch welche Variationen in der Expression von SRP14-AS1 und TDP-43 die Anfälligkeit für diese Erkrankung beeinflussen, erforschen. In einem umfassenden Arbeitsprogramm werden wir im Detail die dynamische Regulation und die Mechanismen der frühen Stress Antwort, der funktionellen Interaktion von Ewing Sarkom Anfälligkeitsloci in der Bildung von Stress Granules, und die Rolle der langen, nicht-kodierenden RNA SRP14-AS1 und der damit assoziierten Proteine in diesem Prozess erforschen. Diese Ziele wollen wir durch Anwendung modernster Gene-Editing, epigenetischer und proteomischer Methoden erreichen. Zuletzt werden wir erforschen, ob SRP14-AS1 Expression als ein potentieller prediktiver Biomarker für die Anfälligkeit für das Ewing Sarkom dienen kann, und ob Substanzen, die Stress Granules inhibieren, anti-Tumor Aktivität aufweisen. Dieses Projekt wird deshalb völlig neue Einsichten in neuartige Mechanismen der Tumorprädisposition, die von langer nicht-kodierender RNA vermittelt wird, erbringen.

Das Ewing Sarkom ist der zweithäufigste bösartige Knochentumor. Er betrifft Kinder und junge Erwachsene vornehmlich in der Pubertät. Die Erkrankung wird von einer chromosomalen Umlagerung ausgelöst, welche die zelluläre Genexpression in Unordnung bringt und zu unkontrolliertem Wachstum führt. Dabei spielt ein in Folge dieser genetischen Veränderung entstehendes Fusionsprotein, EWS-FLI1, eine zentrale Rolle. Aus noch nicht geklärten Gründen tritt der Tumor bei Menschen afrikanischer oder südostasiatischer Herkunft ungefähr 100-mal seltener auf als bei Menschen europäischer Herkunft. Vorangegangene Untersuchungen entdeckten 3 polymorphe chromosomale Regionen, die mit dem Auftreten der Erkrankung in Europäern assoziiert sind. Zwei dieser Regionen enthalten Gene, die eine potenzielle Rolle in der akuten Antwort der Proteinexpression auf verschiedene Formen zellulären Stresses spielen. Dem Projekt lag daher die Annahme zu Grunde, dass die Anfälligkeit für Ewing Sarkom auf unterschiedliche Fähigkeit des Protein Translationssystems mit verschiedenen Formen von Stress umzugehen zurückzuführen sein könnte. Wir testeten diese Hypothese für oxidativen und metabolischen Stress, konnten sie jedoch nicht bestätigen. Unter den verschiedenen Formen von Stress, denen Tumorzellen ausgesetzt sind, befinden sich auch mechanische Reize, welche von der Tumorumgebung und auch durch Tumorzellmigration ausgelöst werden. Mechanischer Stress löst über den sogenannten YAP/TAZ/TEAD Signalübertragungsweg Veränderungen in der Genexpression aus. Unsere vorangegangenen Arbeiten haben gezeigt, dass Fluktuationen in der Expression des EWS-FLI1 Onkogens diesen Signalübertragungsweg anschalten und in der Folge zu verstärkter Invasion und Migration von Ewing Sarkom Zellen führen, welche der Metastasierung zu Grunde liegen. Da die Bildung von Metastasen den Hauptrisikofaktor für Patienten mit Ewing Sarkom darstellt, untersuchten wir, wie sich die Inhibition dieses Mechanismus auf die Tumorzellplastizität und die Bildung von Metastasen auswirkt. Wir fanden, dass EWS-FLI1 vor allem die Expression von TAZ befördert. Wir konnten auf Einzelzellebene zeigen, dass EWS-FLI1 Fluktuationen zur Komplexbildung zwischen den Koaktivatoren YAP und TAZ und dem Transkriptionsfaktor TEAD in einer Subpopulation von Tumorzellen führen. Die Behandlung mit Verteporfin, welches bisher in der Behandlung der altersbedingten Makuladegeneration eingesetzt wurde, vermochte diese Komplexbildungen zu unterdrücken. Dies führte schon im nanomolaren Konzentrationsbereich zu einer Reversion der veränderten Genexpression, und Inhibition der Migration in vitro. In drei Pilotversuchen zur in vivo Anwendung dieses Medikamentes zeigten wir in einem Maus Xenotransplantationsmodell, dass Verteporfin die Bildung von Lungenmetastasen verringerte und verzögerte und die Anzahl der Tumorknoten pro befallene Lunge herabsetzte. Der anti-migratorische Effekt von Verteporfin konnte durch genetische Herabsetzung von TAZ, nicht jedoch durch Depletion von YAP reproduziert werden. Unsere Ergebnisse identifizieren daher den TAZ/TEAD Signalübertragungsweg als vielversprechenden Ansatzpunkt für zukünftige antimetastatische Therapien des Ewing Sarkoms. Da sich Verteporfin auf Grund seiner Lichtsensitivität nicht für systemische Anwendung eignet, testen wir derzeit eine neue Generation von pharmakologischen Inhibitoren, welche sich an TEAD anlagern, auf ihre Fähigkeit die Komplexbildung mit YAP und TAZ zu verhindern und Tumorzellmigration zu unterdrücken.