Ligandeninteraktionen und Selektivität der hepatischen OATPs

Die drei humanen Anionen transportierenden Polypeptide (kurz OATPs für "organic anion transporting polypetides") in der Leber (auch hepatische OATPs), genannt OATP1B1, OATP1B3, und OATP2B1, sind für die ordnungsgemäße Funktion der Leber wichtig, da sie die Aufnahme einer Vielzahl von Substanzen in dieses Organ bewerkstelligen. Es ist jedoch nicht genau bekannt, wie diese drei Transporter im Detail funktionieren, deren Gemeinsamkeiten und Unterschiede. Wir wollen daher verstehen, wie verschiedene Moleküle oder Arzneistoffe mit diesen drei Proteinen auf der molekularen Ebene interagieren, um über treibende Kräfte für das Binden und die Selektivität (bevorzugtes Binden) dieser Proteine Aufschluss zu erhalten. Das neuerworbene Wissen soll dann verwendet werden, um neue Moleküle zu identifizieren, welche mit einem oder mehreren dieser hepatischen OATPs interagieren. Welche Hypothesen stellen wir auf? Die drei hepatischen OATPs weisen Gemeinsamkeiten und Unterschiede bezüglich ihrer Proteinstruktur auf. Diesestrukturellen Unterschiede beeinflussen die Art und Weise in welcher verschiedene Moleküle/Arzneistoffe durch die Transporter erkannt werden. Daher kann ihr biologischer Effekt an den Transportern unterschiedlich sein. Die Aufklärung der Interaktionen von Molekülen mit den OATPs der Leber auf molekularer Ebene wird Einblicke in die Funktionsweise dieser Transporter gewähren, sowie über Gründe für Selektivität Aufschluss geben. Welche Methoden verwenden wir? Dieses Projekt ist als interdisziplinäres Forschungsvorhaben konzipiert, welches Computer-Modelling von Proteinstrukturen und Interaktionen mit Molekülen mit pharmakologischer Testung der Aktivität kombiniert. Computer-generierte Strukturmodelle der drei hepatischen OATPs (OATP1B1, OATP1B3, und OATP2B1) werden auf Basis anderer Proteinstrukturen mit hoher Strukturähnlichkeit konstruiert. Interaktionen der drei hepatischen OATPs mit Molekülen/Arzneistoffen werden mittels "Liganden-Protein Docking" einer großen Anzahl von Molekülen identifiziert, einer Methode, welche mittels Computer die bevorzugte Orientierung chemischer Verbindungen in einem Protein vorhersagt. Neue Moleküle, welche vermeintlich an OATPs binden, werden auf Basis der Computermodelle vorhergesagt und ihre Aktivität experimentell getestet. Was ist neu und besonders an diesem Projekt? Bis heute sind nur sehr wenige Computer-generierte Strukturmodelle von hepatischen OATPs verfügbar und eine großangelegte systematische Docking-Studie wurde noch nie durchgeführt. Unsere Studie vergleicht zum ersten Mal die Molekül-Protein Interaktionen aller drei hepatischer OATPs. Sie wird uns daher Einblicke geben, wie Selektivität dieser Proteine zustande kommt. Zusätzlich wird unsere Studie neue Liganden dieser hepatischen OATPs identifizieren, welche zur funktionellen Charakterisierung der Proteine dienen werden. Zudem wird die Kenntnis über neue OATP-Arzneimittel-Interaktionen dazu beitragen, die Sicherheit von Medikationsschemata in der klinischen Medizin zu erhöhen: wenn ein Arzneistoff den Transporter blockiert, kann ein andere Arzneistoff nicht mehr in die Leber aufgenommen werden. Dies führt häufig zu schwerwiegenden Arzneimittelwechselwirkungen und Nebenwirkungen während einer Arzneimitteltherapie, welche durch die Erkenntnisse unserer Studie verhindert werden können.

LIGANDENINTERAKTIONEN UND SELEKTIVITÄT DER HEPATISCHEN OATPs Hintergrund & Zielsetzung: Die drei humanen Anionen transportierenden Polypeptide (kurz OATPs für "organic anion transporting polypetides") in der Leber (auch hepatische OATPs), genannt OATP1B1, OATP1B3, und OATP2B1, sind für die ordnungsgemäße Funktion der Leber wichtig, da sie die Aufnahme einer Vielzahl von Substanzen (Liganden) in dieses Organ bewerkstelligen. Die Interaktion von einigen Arzneistoffen mit diesen Proteinen kann zu unerwünschten toxischen Effekten, sogenannten Arzneistoffwechselwirkungen, führen, wenn verschiedene Substanzen gleichzeitig verabreicht werden. Als dieses Projekt begann, war nicht ausreichend bekannt, wie die drei Transporter mit verschiedenen Liganden interagieren. Daher war es das vorrangige Ziel dieses Projektes, über die molekulare Basis der Ligandeninteraktionen und Selektivität dieser Proteine Aufschluss zu erhalten. Dies konnte erreicht werden, durch die Generierung von Computer-basierten Modellen für diese Proteine und durch die Simulation der Bindungsprozesse von Molekülen (mit Hilfe einer Technik, welche man als "Molekulares Docking" bezeichnet). Die Modelle wurden auch verwendet, um neue Moleküle zu identifizieren, welche mit einem oder mehreren dieser hepatischen OATPs interagieren. Zur Validierung der Computer-basierten Vorhersagen wurden biochemische Methode verwendet, um die Bindungsstärke der neuen Moleküle zu bestimmen. Was fanden wir heraus? In diesem Projekt konnten wir wichtige Bindungsregionen für die Erkennung von interagierenden Molekülen in den untersuchten Transportern identifizieren. Wir konnten Unterschiede der Interaktionen zwischen den drei Transportern beobachten, wobei Unterschiede zwischen OATP1B1 oder OATP1B3 gegenüber OATP2B1 stärken ausgebildet sind. Wir konnten außerdem spezifische Aminosäuren lokalisieren, welche für Ligandenselektivität für einen spezifischen Transporter verantwortlich sein könnten. Durch die Untersuchung der dynamischen Bewegungen einer Gruppe von strukturell ähnlichen Proteinen, konnten wir Regionen identifizieren, welche größeren Fluktuationen unterliegen und daher möglicherweise eine größere Rolle für die Erkennung von Molekülen oder in der Funktion der Proteine spielen. Bei Verwendung unserer Modelle zum Zwecke der Identifizierung neuer Liganden (mit Hilfe einer Technik, welche "Virtuelles Screening" genannt wird), konnten wir sechs neue Inhibitoren mit mäßig starker bis starker Affinität identifizieren. Welche Schwierigkeiten mussten wir überwinden? Zu Beginn des Projektes waren noch wenige Bioaktivitätsdaten für OATP2B1 vorhanden und es gab keine vergleichenden Studien aller drei Proteine. Daher mussten wir eine umfangreiche Datensammlung durchführen. Es ist außerdem schwierig Transportproteine zu modellieren, da es keine strukturellen Vorlagen gibt. Daher musste eine Technik verwendet werden, welche Proteinstrukturen verschiedener Proteinfamilien vergleicht. Da Transporter dynamisch sind, war es außerdem notwendig Proteinflexibilität in das Modellieren mit einzubeziehen. Welche Auswirkungen hat das Projekt? Die neu identifizierten Liganden können für zukünftige funktionelle Studien verwendet werden. Erworbenes Wissen über diese Transporter und über ihre Gemeinsamkeiten und Unterschiede trägt zur Vermeidung von unerwünschten Arzneimittelinteraktionen bei. Die entwickelten computer-basierten Methoden können für die Modellierung anderer Proteintargets verwendet werden.