Funktionelle Charakterisierung von Transkriptionsfaktoren

Jedes Lebewesen besteht aus vielen verschiedenen Zellen, die alle aus der selben Ursprungszelle entstanden sind. Die Diversität in Form und Funktion zwischen verschiedenen Zellen entsteht durch die zellspezifische Aktivierung von verschiedenen Genomabschnitten, sogenannten Genen. Die Regulation dieser Gene ist komplex und wird von bestimmten regulatorischen Proteinen bestimmt, sogenannten Transkriptionsfaktoren und Kofaktoren. Transkriptionsfaktoren erkennen einerseits (mittels ihrer DNA-Bindungs-Domäne) einen bestimmten DNA-Abschnitt und aktivieren andererseits (via einer sogenannten Aktivierungsdomäne oder TAD) Transkription, indem sie mittels der TAD Kofaktoren rekrutieren. Die DNA-Bindungs-Domäne vieler Transkriptionsfaktoren ist gut charakterisiert. Im Gegensatz dazu sind nur wenige TADs beschrieben und die für die TAD- Funktionalität wichtige Sequenzmuster oft unbekannt. Unser Ziel ist es, ein neues Verfahren (TAD-seq) zu entwickeln, mit welchem zeitgleich hunderte Transkriptionsfaktoren auf ihre Aktivierungsdomäne untersucht werden können. Hierfür fragmentieren wir die Transkriptionsfaktoren willkürlich in gleich lange Fragmente und testen deren Funktionalität unter anderem mittels neuartiger DNA-Sequenziermethoden (Next-Generation- Sequencing, NGS). Dabei werden wir Varianten von TAD-seq entwickeln, die spezifische Funktionen verschiedener Typen von Transkriptionsfaktoren messen können. Vor Kurzem konnten wir, zusätzlich zu den starken globalen Aktivatoren, sogenannte Haushalt (Housekeeping) Regulatoren, und kombinatorische Faktoren beschreiben. In weiterer Folge analysieren wir, mittels computergestützter Datenanalyse, die Sequenzen dieser Fragmente, um Ähnlichkeiten zwischen verschiedenen TADs zu erkennen. Dies könnte in weiterer Folge Aufschluss geben, welche Sequenzbereiche und muster für die Aktivierungsfunktionen der TADs von Bedeutung sind. Die Wichtigkeit dieser Bereiche und Motive werden wir mittels Mutationsanalyse testen. Da Transkriptionsfaktoren und auch deren Aktivierungsdomäne zwischen verschiedenen Lebewesen funktionell stark konserviert sind (so funktionieren z.B. Transkriptionsfaktoren von Hefezellen auch in Fliegen-, Menschen- und Pflanzenzellen), erwarten wir, dass unsere Ergebnisse wichtige Einblicke in die Funktionsweise von Transkriptionsfaktoren und der Transkription insgesamt erlauben, die weitläufig auf verschiedene Lebewesen und auch auf den Menschen zutreffen. Da neuartige Therapieansätze z.B. in der Krebstherapie, oft darauf basieren Genexpression gezielt zu beeinflussen ist ein tiefergehendes Verständnis der Genexpression, wie von uns angestrebt, gerade heutzutage von enormer Wichtigkeit.

Jedes Lebewesen besteht aus vielen verschiedenen Zellen, die alle aus derselben Ursprungszelle entstanden sind. Die Diversität in Form und Funktion zwischen verschiedenen Zellen entsteht durch die zellspezifische Aktivierung von verschiedenen Genomabschnitten, sogenannten Genen. Die Regulation dieser Gene ist komplex und wird von bestimmten regulatorischen Proteinen bestimmt, sogenannten Transkriptionsfaktoren und Kofaktoren. Transkriptionsfaktoren erkennen einerseits (mittels ihrer DNA-Bindungs-Domäne) einen bestimmten DNA-Abschnitt und aktivieren andererseits (via einer sogenannten Aktivierungsdomäne oder tAD) Transkription, indem sie mittels der tAD Kofaktoren rekrutieren. Die DNA-Bindungs-Domäne vieler Transkriptionsfaktoren ist gut charakterisiert. Im Gegensatz dazu sind nur wenige tADs beschrieben und die für die tAD-Funktionalität wichtige Sequenzmuster oft unbekannt. Mit Hilfe der Förderung des FWFs haben wir ein neues Verfahren (tAD-seq) entwickelt, mit welchem wir zeitgleich hunderte Transkriptionsfaktoren auf ihre Aktivierungsdomäne untersucht haben. Hierfür fragmentierten wir die Transkriptionsfaktoren willkürlich in gleich lange Fragmente und testen deren Funktionalität unter anderem mittels neuartiger DNA-Sequenziermethoden ("Next-Generation-Sequencing", NGS). Dabei konnten wir verschiedene Arten von tADs mit unterschiedlicher Sequenzzusammensetzung bestimmen. Diese analysierten wir, mittels computergestützter Datenanalyse, und konnten bestimmen welche Sequenzbereiche und -muster für die Aktivierungsfunktionen der TADs von Bedeutung sind. Die Wichtigkeit dieser Bereiche und Motive wurden dann mittels Mutationsanalyse getestet und validiert. Da Transkriptionsfaktoren und auch deren Aktivierungsdomäne zwischen verschiedenen Lebewesen funktionell stark konserviert sind (so funktionieren z.B. Transkriptionsfaktoren von Hefezellen auch in Fliegen-, Menschen- und Pflanzenzellen), erwarten wir, dass unsere Ergebnisse wichtige Einblicke in die Funktionsweise von Transkriptionsfaktoren und der Transkription insgesamt erlauben, die weitläufig auf verschiedene Lebewesen und auch auf den Menschen zutreffen. Zudem wurde unsere Methode tAD-seq von uns und anderen Gruppen auf ähnliche und erweiterte Fragestellungen angewandt. Da neuartige Therapieansätze z.B. in der Krebstherapie, oft darauf basieren Genexpression gezielt zu beeinflussen ist ein tiefergehendes Verständnis der Genexpression, wie von uns angestrebt, gerade heutzutage von enormer Wichtigkeit.