S-Schicht Recrystallization durch hydrophobische/hydrophilische "Nanoprotrusions"

Bakterielle Oberflächenproteine (S-Schicht) haben die Fähigkeit Protein-Kristallschichten mit Regelmäßigkeit im Nanometerbereich auf Luft/Wasser Grenzflächen und auf vielen verschiedenen Substraten zu bilden. Diese werden momentan als Nano-Templates für unterschiedliche biotechnologische Anwendungen getestet. Die Art und Weise wie diese Proteine selbst assemblieren und dabei geordnete Nanostrukturen formen, ist jedoch noch nicht vollständig geklärt. In diesem Zusammenhang beabsichtigen wir die Rekristallisation von drei S-Schicht Proteinen, Wildtyp SbpA und die rekombinanten Proteine rSbpA31-1068 und rSbpA31-918 auf (molekular kontrollierten) hydrophoben und hydrophilen Disulfiden zu erforschen. Zunächst werden wir die Adsorptionskinetik und die Rekristallisation dieser drei bakteriellen Proteine untersuchen. Zweitens wollen wir den Zusammenhang zwischen der Kinetik und den physikalischen Eigenschaften der gebildeten Proteinkristalle (z.B. Kristallgröße, Gitterparameter) herausfinden. Zuletzt möchten wir die Frage der Rekristallisationswege in Abhängigkeit von den Substrat-Eigenschaften für diese bakteriellen Proteine klären (was uns auch Verständnis über Protein/Substrat Interaktionen liefert, vor allem über die Wiedererkennung der Proteine von hydrophoben und/oder hydrophilen Teilen. Hypothesen Die Haupthypothesen in diesem Projektes sind: i) Die Länge der hydrophoben/hydrophilen Nanoprotrusionen sollte den Rekristallisationsweg und die Adsorptionskinetik beeinflussen; ii) Hydrophobe/hydrophile Nanoprotrusionen könnten eine Änderung von einer Monoschicht zur Doppelschicht und auch eine andere Orientierung der Proteine induzieren (die drei Proteine sollten sich unterschiedlich verhalten); iii) Verdeutlichung des Screenings von hydrophoben Interaktionen durch Hinzufügen von hydrophilen Gruppen zum Protein, und iv) Ähnliche Proteine sollten dem gleichen Rekristallisationsweg folgen). Methoden Rasterkraftmikroskopie,Quarzkristall-WaagemitDissipation,Elektronenmikroskopie, elektrophoretische Mobilität, Infrarotspektroskopie, chemische Modifizierung der Oberfläche, Zellkultur und Techniken der Molekularbiologie (z.B. rekombinante Proteine). Novität und Originalität dieses Projektes Das Projekt bietet eine systematische Studie über den Aufbau biomimetischer Oberflächen, bestehend aus bakteriellen Proteinen mit unterschiedlichen physikalischen und chemischen Eigenschaften. Dies kann durch Änderung der Länge (einige C-C Bindungen) des hydrophoben Teils der Disulfide erreicht werden. Von der akademischen Perspektive aus ermöglicht das geplante System die Validität der Theorien über klassische und nicht-klassische Kristallisation zu untersuchen und liefert ebenso Informationen über die Interaktion zwischen bakteriellen Proteinen und hydrophober und hydrophilischer Grenzflächen. Die Kontrolle der Kinetik und die endgültige Kristallstruktur des Proteins (als neuer Bottom-up-Ansatz) werden für biotechnologische Anwendungen der S-Schicht wichtig sein (z.B. Biosensorik, antifouling und smart surfaces, Biomineralisation, etc.). Stichwörter:S-Schichten,rekombinante Proteine,2-D Proteinkristalle,Biomimetik, Rasterkraftmikroskopie, Quartzkristall-Waage mit Dissipation, Infrarotspektroskopie, klassische und nicht-klassische Kristallisation.

Das Hauptziel dieses Projekts bestand darin, die Rekristallisationswege von drei S-Schicht-Proteinen aufzuklären. Dies wurde durch kontrollierte chemische Veränderungen der Substrate erreicht. Weitere Ziele waren: i) die Quantifizierung der Rekristallisationskinetik, der Gitterparameter der gebildeten Proteinkristallschicht und der Kristalldomänengröße; ii) der Einfluss der Substratbeschaffenheit und des Proteintyps auf die thermodynamischen und kinetischen Parameter und die endgültige Nanostruktur der kristallinen Proteinschicht; und iii) der Vergleich unserer Ergebnisse mit klassischen und nicht-klassischen Rekristallisationstheorien und -modellen. Zunächst setzten wir SbpA-Bakterienproteine chemischen Gruppen mit Hydroxyl-Endgruppen (-OH) und Methyl-Endgruppen (-CH3) aus. Wir untersuchten die Proteinadsorption und Kristallbildung mit Rasterkraftmikroskopie (AFM). Mit der Quarzkristallmikrowaage mit Dissipation (QCM-D) wurde die Kinetik des Prozesses (und die Menge des adsorbierten Proteins) quantifiziert. Die Adsorption erfolgte schneller auf hydrophoben Oberflächen. Das Wechselspiel zwischen Proteinkonzentration und Messzeit für die Kristallbildung wurde auch auf hydrophoben, fluoridfunktionalisierten SiO2-Oberflächen untersucht. Die Ergebnisse zeigten: (1) Kristallbildung fand bei Konzentrationen über 0,08 M statt, (2) die Kristallnachgiebigkeit nahm mit steigender Proteinkonzentration ab und (3) Protein-Substrat-Wechselwirkungen schienen gegenüber Protein-Protein-Wechselwirkungen zu überwiegen. Alle beobachteten Kristalldomänen hatten ähnliche Gitterparameter (a = 14,8 0,5 nm, b = 14,7 0,5 nm, = 90 2). Die Proteinfilmbildung begann von anfänglichen Keimbildungspunkten aus, die eine allmähliche und schnelle Ausdehnung der kristallinen Domänen bewirkten. Das Kristallwachstum konnte mit der Avrami-Gleichung modelliert werden. Darüber hinaus wurde in dynamischen Experimenten die Bildung eines geschlossenen und kristallinen Proteinfilms selbst bei niedrigen Proteinkonzentrationen (d. h. 10 g/ml) nachgewiesen. Dies ist ein wichtiges Ergebnis, da sich eine solche Proteinschicht unter statischen Fließbedingungen nicht bilden kann. Es wurde ein neues probabilistisches Modell zur Erklärung und Vorhersage des 2D-Proteinkristallwachstums auf der Mikroskala entwickelt. Dies könnte erreicht werden, indem das räumliche Wachstum des Massenkristalls simuliert wird, ohne die einzelnen Bestandteile des Kristalls zu berücksichtigen: ihre Orientierung, den Keimbildungsprozess und/oder andere energetische Überlegungen. Wir betrachteten ein probabilistisches Modell und denierten alle darin enthaltenen Parameter. Bei diesem Modell wurde auch der verfügbare Raum für das Wachstum berücksichtigt. Schließlich haben wir die Antifouling-Eigenschaften von 2-D-Bakterienproteinkristallen für Messungen von Zelloberflächen- und Zell-Zell-Interaktionen untersucht.