Biologische Funktion von m5C RNA Methylierung in Drosophila

Für lange Zeit wurde der Informationsfluss von DNS zu Proteinen als eine Abfolge von Mechanismen angesehen, die genetisch-kodierte Sequenz exakt von DNS zu RNS zu Protein übersetzen. Jedoch ist es wichtig, dass auch die Bausteine der kopierten Sequenzen (Nukleotide als auch Aminosäuren) selbst Substrate von molekularen Prozessen werden können, die deren chemische Identität post-synthetisch verändern. Die Existenz dieser Modifikationen und letztlich deren Einfluss auf die Übersetzung der zugrunde liegenden Sequenzen, beeinflusst den Fluss der genetisch kodierten Information auf verschiedenen epigenetischen Ebenen, die somit zur Regulation von Genexpression beitragen. Chemische und kovalente Modifikation von RNS und DNS-Molekülen ist in den meisten Organismen zu detektieren. Wichtig dabei ist, dass RNS 10mal mehr chemische Modifikationen als DNS trägt. Die meisten dieser Modifikationen schließen methylierte Gruppen ein, was darauf hinweist, dass diese einfache Modifikation multifunktional genutzt wird. Zum Beispiel enthalten eukaryotische Genome zahlreiche (Cytosin-5) RNS-Methyltransferasen (RCMTs),deren biologische Funktion jedoch für lange Zeit unbekannt geblieben ist. Jüngste Studien haben überzeugende Beweise dafür geliefert, dass die (Cytosin-5) RNS-Methylierung einen wichtigen Beitrag zu diverse Prozessen wie Stressreaktionen, angeborener Immunitätund Proliferationskontrolle liefert. Informationen über die biologische Funktion von (Cytosin-5) RNS Methylierungen wurden bis jetzt jedoch hauptsächlich von phänotypischen Analysen einzelner RCMT Mutationen abgeleitet. Wichtig dabei ist, dass die molekularen Prozesse, die das korrekte Platzieren, die Detektion und das Interpretieren von 5-Methylcytosin in RNS regulieren weitgehend unbekannt geblieben sind. Der Schwerpunkt dieses Antrags ist die systematische Charakterisierung von (Cytosin-5) RNS- Methylierungs-Systemen in der Fruchtfliege Drosophila melanogaster. Fruchtfliegen kodieren Homologe der meisten Säugetier RCMTs, und bieten daher einen leicht zugänglichen Einstiegspunkt für die molekulare Charakterisierung von RNS-Methylierungs-Systemen in Säugetieren. Zwei Drosophila RCMTs, NSun2 (CG6133) und NSun6 (CG11109) werden genetisch manipuliert werden, um deren gewebespezifische und subzelluläre Lokalisierung, ihre Wechselwirkungen mit anderen Proteinen und RNS-Bindungspartnern zu definieren, und um die Phänotypen von Mutationen analysieren zu können. Darüber hinaus werden gewebespezifische RNS-Methylierungs-Analysen unter Verwendung von kürzlich entwickelten Technologien wie miCLiP und RNS-Bisulfit-Sequenzierung durchgeführt werden. Die Charakterisierung von RCMT Interaktionen und Funktion unter normalen als auch unter Nicht- Standard-Labor Bedingungen(z.B.Stress) wird wichtigeInformationen überdie Substratspezifitäten und die funktionale Dynamik dieser hochkonservierten RCMTs liefern. Das Studium von (Cytosin-5) RNS-Methylierungs-Systemen in Drosophila wird von großer Bedeutung für die Aufklärung der molekularen Mechanismen sein, die zu fehlerhaften RNS- Methylierungs-Mustern und deren Folgen für den Organismus beitragen.

Der Fluss von genetischer Information von DNA über RNA zu Protein kann auf verschiedenen Ebenen moduliert werden. Eine faszinierende Möglichkeit, diesen Informationsfluss zu verändern, stellen chemische Modifikationen dar, die durch ein Netzwerk enzymatischer Aktivitäten an DNA und/oder RNA angebracht werden. Diese Proteine können auf Veränderungen in der Umgebung reagieren, was bis dato, zu unverstandenen Auswirkungen auf ihre Substrate (DNAs und/oder RNAs) führen kann. Die Ergebnisse dieses Projekts, das sich auf eine bestimmte Klasse von Proteinen konzentrierte, die RNA oder DNA mittels bestimmter chemischer Gruppen verändern, trugen zu einem besseren Verständnis der biologischen Funktion dieser Enzyme bei. Unter Verwendung der Fruchtfliege untersuchte das Projekt die molekulare Funktion von zwei Proteinen, X und Y, die eindeutig RNA modifizieren, während die oft diskutierte Beteiligung von X an der Modifikation von DNA zusätzlich geklärt wurde. Die veröffentlichten Ergebnisse zeigten, dass X nicht an der chemischen Modifikation von DNA beteiligt ist; die Funktion von X oder Y wichtig ist, um bestimmte Regionen zu kontrollieren, die in vielen Kopien im Erbgut vorliegen; X-vermittelte Kontrolle dieser Regionen nur nach Hitzestress nachweisbar ist, was darauf hindeutet, dass Umweltveränderungen von X wahrgenommen werden; Y-vermittelte Kontrolle dieser Regionen unabhängig von Hitzestress funktioniert; und in Organismen ohne X oder Y spezifische kleine RNAs, die für die Proteinsynthese wichtig sind, in Anzahl bzw. fragmentiert werden, während die Integrität des Erbguts in spezifischen Regionen verloren geht. Diese Ergebnisse deckten einen Zusammenhang zwischen der molekularen Aktivität von RNA-Modifikationsenzymen und der Stabilität des Erbguts auf. Die Ergebnisse sind von großer Relevanz für das Gebiet der RNA-Modifikationsforschung, weil sie zeigen, dass Mutationen in RNA-Modifikationsenzymen sehr komplexe Auswirkungen haben können. Diese Ergebnisse haben auch die Grundlage für weiterführende Forschung geschaffen, insbesondere die Details die Verbindung von Erbgut-Integrität und RNA Modifikationen näher zu untersuchen. Weitere Studien konzentrierten sich auf die Folgen der verringerten Stabilität kleiner RNAs in Organismen ohne X und Y. Insbesondere wurden die möglichen biologischen Auswirkungen von RNA-Fragmenten, die während der Reaktion auf Stressbedingungen gebildet werden, in Betracht gezogen. Um mechanistische Studien an RNA-Fragmenten zu ermöglichen, wurde eine biochemische Methode zur Aufreinigung entwickelt, die es ermöglicht, die tatsächliche Anzahl dieser RNA-Fragmente in einzelnen Zellen zu zählen, deren chemischen Modifikationsstatus zu bestimmen und auch deren Bindungspartner zu entdecken. Die veröffentlichten Ergebnisse sind wichtig für zukünftige Studien zur Rolle von RNA-Fragmenten, welche gerade in Zellen mit eingeschränkter Funktion von RNA Modifikationsenzymen (wie X oder Y) produziert werden.