Rolle der LETM1 Proteinfamilie in der Entwicklung des Zebrafish

LETM1 ist eines der neulich identifizierten ~ 2000 essentiellen humane Gene, die lebensnotwendige zelluläre Funktionen ausüben ohne die wir nicht überleben könnten. Es ist in allen Eukaryonten konserviert und reguliert die Funktionen unserer Mitochondrien. Diese Zellorganellen spielen eine Schlüsselrolle in der Erzeugung des Energiemoleküls ATP. Außerdem sind Mitochondrien für die Energiespeicherung, für den Zucker- und Fett-Stoffwechsel der zur Bildung von Nukleotiden und Aminosäuren herangezogen wird, für den Aufbau von Eisenschwefel-cluster sowie für die Entscheidungen über den programmierten Zelltod verantwortlich. Für ihre korrekte Funktion ist ein ausgewogenes Gleichgewicht des Volumens und der Ionen innerhalb der Mitochondrien erforderlich. Dieses Gleichgewicht wird von Schlüsselmolekülen wie LETM1 reguliert. Fehlregulierungen der Mitochondrien durch Genveränderungen oder Deletionen sind mit zahlreichen Erkrankungen assoziiert. Das Wolf-Hirschhorn Syndrom (WHS) ist eine komplexe und schwere Kindererkrankung, die durch das Fehlen eines ganzen Genabschnittes verursacht und durch Fehlbildungen, mentale Retardierungen, Wachstumsverzögerungen und Epilepsie gezeichnet ist. LETM1 ist eines der fehlenden Gene und wurde für das Auftreten von Epilepsie im WHS verantwortlich gemacht. Um der Fragestellung auf den Grund zu gehen, wie LETM1 bedingte mitochondrielle Schäden mit veränderten Gehirn und Nervenfunktionen und des Weiteren mit Epilepsiesymptomen verknüpft sind, wollen wir in dieser Studie zum ersten Mal die biologische Rolle von LETM1 in der Entwicklung aufspüren. Daher wird im Zebrafish (Danio rerio, Dre), als idealem Vertebraten Model für die Entwicklungsbiologie, die Rolle von LETM1 und der Mitochondrien in der embryonalen und adulten Phase charakterisiert. Der Zebrafish hat 2 LETM1 engverwandte Gene: Dre-letm1 und Dre-letm2. Wir werden deren Expressionsmuster in frühen Entwicklungsstadien bestimmen. Mittels neuester Technologie werden Fischlinien mit grün fluoreszierenden Mitochondrien generiert, denen Dre-letm1 oder Dre-letm2 (KO) fehlt. Somit können wir morphologische Veränderungen der Mitochondrien verfolgen. Des Weiteren werden wir den Energiehaushalt und Stoffwechsel in Organen charakterisieren, die viel Energie verbrauchen. In Fischlinien die Dre-letm1 und letm2 Wild typ oder KO sind und dessen Nervenzellen mit einem fluoreszierenden Kalziummarker gekennzeichnet sind, werden die Aktivitätssignale in Nervenzellen analysiert. Um nachzuprüfen ob mitochondrielle und neuronale Fehlfunktionen mit lokomotorischen Veränderungen in einem Zusammenhang stehen, werden auch Schwimmverhaltensstudien der Zebrafische in verschiedenen Entwicklungsstadien durchgeführt. Außerdem wollen wir zum ersten Mal untersuchen, ob festgestellte Schwimmfehlfunktionen durch spezielle chemische Substanzen, die mitochondrielle Funktionen verbessern können, behoben werden und die Zebrafishe geheilt werden können. Insgesamt soll diese Studie aufzeichnen ob und wie Dre-letm1/letm2 verursachte mitochondrielle Dysfunktionen frühe Entwicklung und neuronale Funktionen beeinträchtigen. Die Ergebnisse der Studie sollen die funktionelle Vernetzung von Gehirn, Nerven und Mitochondrien hervorheben. Des Weiteren, könnte das hier geschaffene Zebrafishmodel für zukünftige Drogenscreenings zur Behandlung von Epilepsie herangezogen werden.

Mitochondrien puffern intrazelluläre Kationen und versorgen unsere Zellen Tag und Nacht mit Energie und Stoffwechselprodukten, halten die Zellen am Leben und ermöglichen ihnen, ihre hochspezialisierten Funktionen zum richtigen Zeitpunkt zu erfüllen. Eine Störung ihrer Stoffwechselfunktionen gefährdet die Zelle und den gesamten Organismus. Funktionierende Mitochondrien erfordern kontrollierte Kationentransportaktivitäten, um ihr Volumen in Form halten. LETM1 ist deren wichtigster osmotische Regulator, und sein Fehlen führt zu geschwollenen und beschädigten Mitochondrien. Beim Menschen ist der Verlust von LETM1 mit einer Reihe von Krankheiten wie Epilepsie, Diabetes oder Krebs verbunden. Wie der Verlust von LETM1 zu solchen Störungen im Organismus führt, ist jedoch nicht verstanden. Wir haben die hohe evolutionäre Genkonservierung von LETM1 in Mensch und Tieren und die Tageszeit abhängige Natur des Wirbeltiers Zebrafisch, der wie der Mensch tagsüber aktiv ist und nachts ruht, genutzt und ein Zebrafischmodell erzeugt, das unverändertes letm1 (+/+) exprimiert, oder wo letm1 auf beiden Chromosomen mittels neuer Technologien ausgeschalten (-/-) wurde. Unsere Studie hat unerwartete Aspekte der Regulierung und der Funktionsstörung von letm1 in der Entwicklung des Zebrafischs aufgedeckt. Wir konnten zeigen, dass letm1 im Embryo, wie auch im juvenilen und adulten letm1+/+ Zebrafischen stark exprimiert wird, wobei die Konzentration im Gehirn erhöht ist. Wir bestätigten das Letm1 in Mitochondrien lokalisiert und entdeckten, dass dessen Konzentration entsprechend des Tag/Nacht ("zirkadian") Zyklus reguliert wird und nachts am höchsten und um die Mittagszeit am niedrigsten ist. Ausschaltung von letm1 führte zu hoher embryonaler Sterblichkeit, obwohl eine kleine Population von Nachkommen überlebte. Diese einmalige Gelegenheit ermöglichte die Untersuchung von Unterschieden zwischen nicht überlebenden und überlebenden letm1-/- Larven und von Kompensationsmechanismen der letzteren, und lieferte neue funktionelle Erkenntnisse an der Schnittstelle zwischen mitochondrialer Biologie und Chronobiologie. Entwicklungsfehlbildungen, gestörte mitochondriale Morphologie und ein veränderter Stoffwechsel von Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD und NADH), ein wichtiger Faktor in der Regulierung des Tag/Nacht Rhythmus, traten als sehr frühe Anzeichen eines letm1-Mangels auf. Dieser Mangel ging mit verändertem Expressionsmusters von nampt1/2 und den Genen der biologischen Uhr in den überlebenden letm1-/- Larven einher. nampt1/2 Gene sind maßgebend für den NAD Stoffwechsel und waren morgens hochreguliert, um möglicherweise die nachts aufgebrauchten NAD(H) Reserven aufzufüllen. Auch war die Expression der Uhrengene clock1a, per1b und per2 zu ihren natürlichen Spitzenwerten ebenfalls deutlich erhöht. Die Hochregulierung des NAD-Stoffwechsels und der zirkadianen Uhren in den überlebenden letm1-/- Larven scheint wesentlich zu deren Überleben und Entwicklung zu gesunden erwachsenen Zebrafischen beizutragen. Eine globale Genexpressionsanalyse zur Identifizierung potenzieller anderer Überlebensmechanismen bestätigte die Rolle des NAD-Stoffwechsels und deuteten auf starke Veränderungen des Immunsystems in den nicht Überlebenden. Diese neue Erkenntnisse sind für menschliche LETM1-verursachten Erkrankungen von großer klinischen Bedeutung und Gegenstand künftiger Studien.