NMR Spektroskopie von hyperphosphorylierten Proteinen

Ziel des vorgeschlagenen Forschungsprojektes ist, zu untersuchen, wie kompakte Konformationen von intrinsisch ungeordneten Proteinen (IDPs) durch post-translationale Modifikation und Interaktionen mit Liganden beeinflusst werden. Durch Verwendung neuartiger NMR-spektroskopischer Methoden, die auf paramagnetischer Relaxations- Verstärkung (Paramagnetic Relaxation Enhancement, PRE) und kreuzkorrelierter NMR-Spin- Relaxation (CCR) beruhen, wollen wir das dynamische Konformationsensemble eines hyperphosphorylierten, intrinsisch ungeordneten Proteins beschreiben. Im gegenständlichen Forschungsprojekt wird das extrazelluläre Matrix-Protein Osteopontin (OPN) untersucht, das eine wichtige Rolle in der Tumorentstehung und Progression (Metastasierung) spielt. Proteine ohne ausgeprägte (stabile) Tertiärstruktur stellen das zentrale Struktur- Funktions-Paradigma der Strukturbiologie grundlegend in Frage und sind daher seit einiger Zeit im Fokus der molekularbiologischen Forschung. Aufgrund ihrer Konformations- flexibilität besitzen diese Polypeptide wichtige, regulatorische Funktionen und spielen eine zentrale Rolle in vielen Signalwegen. Die inhärente strukturelle Flexibilität der IDPs erfordert die Entwicklung geeigneter experimenteller Methoden, da die zumeist verwendete Röntgenkristallographie nicht anwendbar ist. Im Gegensatz dazu bietet die NMR- Spektroskopie einzigartige Möglichkeiten für strukturelle und dynamische Studien von IDPs. Im gegenständlichen Projekt werden wir anspruchsvolle NMR-Methoden verwenden, um den Einfluß post-translationaler Modifizierungen auf die Strukturdynamik von intrinsisch ungeordneten Proteinen zu untersuchen. Mit der Anwendungen auf Osteopontin wird wissenschaftliches Neuland betreten, da noch kein hyperphosphoryliertes IDP mittels NMR- Spektroskopie strukturell untersucht wurde. Die zu erwartenden Ergebnisse werden nicht nur neue Einblicke in den Konformationsraum dieses medizinisch höchst relevanten Proteins liefern, sondern darauf aufbauend- neuartige Möglichkeiten zur therapeutischen Intervention bislang nicht zugänglicher Proteine ermöglichen.

Ziel des vorgeschlagenen Forschungsprojektes ist, zu untersuchen, wie kompakte Konformationen von intrinsisch ungeordneten Proteinen (IDPs) durch post-translationale Modifikation und Interaktionen mit Liganden beeinflusst werden. Durch Verwendung neuartiger NMR-spektroskopischer Methoden, die auf paramagnetischer Relaxations-Verstärkung (Paramagnetic Relaxation Enhancement, PRE) und kreuzkorrelierter NMR-Spin-Relaxation (CCR) beruhen, wollen wir das dynamische Konformationsensemble eines hyperphosphorylierten, intrinsisch ungeordneten Proteins beschreiben. Im gegenständlichen Forschungsprojekt wird das extrazelluläre Matrix-Protein Osteopontin (OPN) untersucht, das eine wichtige Rolle in der Tumorentstehung und Progression (Metastasierung) spielt. Ausgangspunkt des Forschungsprojektes war die Entwicklung einer effizienten proteinchemischen Methode, um phosphoryliertes Osteopontin in ausreichender Menge im Labor synthetisieren zu können. In einem nächsten Schritt wurde der Einfluß dieser post-translationalen Modifzierung auf die Struktur und Dynamik des Proteins untersucht. Durch Verwendung von paramagnetischer Relaxations-Verstärkung (Paramagnetic Relaxation Enhancement, PRE) konnte gezeigt werden, dass die Phosphorylierung zu einer signifikanten strukturellen Expansion und zunehmender Flexibilität des Proteins führt. Zur genaueren Charakterisierung der biologisch bedeutsamen Interaktion zwischen Osteopontin und zellulären Rezeptoren wurde eine experimentelle Methode entwickelt, die auf neuartige Weise zellbiologische und NMR-spektroskopische Techniken kombiniert. Mithilfe dieser neuen Methode konnte im Anschluß auch die Interaktion zwischen Osteopontin und Hydroxyapatit-Nanopartikeln genauer untersucht werden. Zuletzt wurden im Rahmen des Projektes neue NMR Pulssequenzen zur Messung und quantitativen Analyse von kreuz-korrelierten Relaxationsparametern entwickelt, die in Zukunft noch detailliertere Einblicke in die strukturelle Dynamik von Proteinen erlauben und dadurch neue Interventionsstrategien für therapeutische Anwendungen ermöglichen. Die zu erwartenden Ergebnisse werden nicht nur neue Einblicke in den Konformationsraum dieses medizinisch höchst relevanten Proteins liefern, sondern -darauf aufbauend- neuartige Möglichkeiten zur therapeutischen Intervention bislang nicht zugänglicher Proteine ermöglichen.