Mechanismus der intrazellulären Invasion von Y. ruckeri

Inhalt des Forschungs-Projektes: Die Fähigkeit, in non-professionelle phagozytische Zellen einzudringen und innerhalb sich innerhalb dieser zu vermehren, sowie die Phagozytose zu überstehen sind wichtige Eigenschaften des Krankheitsprozesses bei vielen bakteriellen Pathogenen, einschließlich Fisch-Pathogenen. Studien in der Humanmedizin haben gezeigt, dass die meisten fakultativen intrazellulären Bakterien verschiedene Mechanismen der Wirt-Zellen übernehmen, um intrazellulären Zugang zu erhalten, aber über derartige Pathogene in Fischen ist kaum etwas bekannt. Hypothese: Wir haben 20 Gene ausgewählt, die in Zusammenhang mit Genen stehen, die eine Rolle im intrazellulären Überleben und bei der Vermehrung anderer bakterieller Pathogene spielen. Unsere Hypothese ist, dass mehrere dieser Gene auch Yersinia ruckeri sind und dass, durch Beeinflussung dieser Gene, die Fähigkeit der Bakterien, diese Zellen zu befallen und sich innerhalb zu vermehren, eingeschränkt wird. Methoden: Innerhalb dieses Projektes werden die Zellstrukturen genutzt, die zuerst chemischen Hemmstoffen ausgesetzt werden, dann die meisten zellulären Funktionen blockieren und bakteriellen Pathogenen Zugang zum Wirt ermöglichen. Als nächstes kommen kleine inhibitorische RNAs innerhalb der ausgewählten Gene des Wirt-Genoms zum Einsatz. Gemessen wird der Effekt beider hemmenden Methoden auf die Anfälligkeit der Zellen, die mit das Fisch- Pathogen Y. ruckeri infiziert werden. Außerdem wird Proteomik bei den infizierten Zellen angewandt, um den Einfluss von Bakterien auf die Eigenschaften des Proteins zu zeigen. Neue und einzigartige Aspekte des Projekts: In diesem Projekt werden die Gene der drei Fischpathogenen, die für das Eindringen der Bakterien in der Wirtszelle verantwortlich sind untersucht. Dieses Thema ist an mehreren human Pathogenen Erreger untersucht worden, allerdings noch nicht bei Fischesn. Weiterhin ist der Einsatz der Proteomik zur Untersuchung, inwieweit bakterielle Krankheitserreger die Proteinprofil der Wirtszellen verändern ist neu und wird durch die Anwendung third generation proteomic apparatus an unsere Universität ermöglicht.

Yersinia ruckeri ist ein wichtiges bakterielles Fischpathogen, das Zuflucht in den Zellen des infizierten Fischwirtes sucht. Die intrazelluläre Lokalisation schützt das Bakterium sowohl vor dem Immunsystem des Wirts als auch vor einigen medikamentösen Wirkstoffen. Der Infektionsmechanismus ist noch nicht vollständig geklärt. Es wird jedoch angenommen, dass er dem seiner Verwandten, den Yersiniaceae ähnlich ist. Diese besitzen jedoch eine Vielzahl an Infektionsmechanismen. Die vorliegende Studie sollte unser Verständnis des Infektionsvorganges von Wirtszellen durch Y. ruckeri verbessern. Insbesondere sollte die Kenntnis über die Vorteile, die das Bakterium aus den Vorgängen in den Wirtszellen zieht, verbessert werden. Im ersten Projektschritt wurde die Eignung des Infektionsverfahrens für mehrere Zellkultur Fischzelllinien mit einem Gentamycin-Assay untersucht. Darüber hinaus wurde die Wirkung von sechs verschiedenen chemischen Blockern analysiert. Da jede dieser Chemikalien auf einen bestimmten Aspekt der Physiologie der Wirtszellen abzielt, konnten wir einige der allgemeinen Eintrittsmechanismen bestimmen: Insbesondere wurde gezeigt, dass die Zugabe von N-Acetylcystein bis zu einer Endkonzentration von 5 mM den Invasionsprozess vollständig stoppt. N-Acetylcystein ist ein Inhibitor des Moleküls Rac1, von dem bekannt ist, dass es sowohl das Actin- als auch das Mikrotubulus-Zytoskelett reguliert. Da die Hemmung eines dieser Wirtsfaktoren für sich genommen nur eine begrenzte Auswirkung auf die Bakterieninvasion hatte, legen diese Ergebnisse nahe, dass Y. ruckeri sowohl das Aktin als auch das Zytoskelett nutzen kann, um in die Zellen des Wirts einzudringen. Der nächste Schritt bestand in der Untersuchung einzelner Wirtsgene. Zu diesem Zweck wurden kleine inhibitorische RNA (siRNA) entwickelt, die für jedes der zwanzig vorgewählten Wirtsgene spezifisch sind. Jedes Mal wurde eine PCR (RT-qPCR) durchgeführt, um zu bestätigen, dass die siRNAs die Expression ihres Zielgens wirksam reduzierten. Anschließend wurde der Effekt jeder Inhibition untersucht. Darüber hinaus wurde ein Trypanblau-Assay angewendet, um zu bestätigen, dass diese Expressionsinhibition keine toxischen Nebenwirkungen auf die Zellen hatte. Die Ergebnisse der Testreihe zeigen, dass 18 von 20 Genen eine Rolle bei der Zellinvasion spielen. Die Inhibition von Rac1 hatte neben der Stummschaltung des Gens, das für die Laminin-Untereinheit alpha-2 (Lama 2) kodiert, erneut den stärksten Effekt. Lama 2 ist ein Adhäsionsmolekül, das auf der Oberfläche der Wirtszellen exprimiert wird und es ihnen ermöglicht, sich an die Basalmembran zu binden. In der Vergangenheit wurde gezeigt, dass Lama 2 eine Bindungsstelle für Yersinia enterocolitica, ein Verwandter von Y. ruckeri, sowie den Plasminogen-Aktivator (Pla) von Y. pestis hat. Abschließend wurde auch die Auswirkung einer bakteriellen Infektion auf das Proteinprofil der Fischzellkultur untersucht. In diesem letzten Projektabschnitt konnten 1 6 1 4 verschiedene Fischproteine identifiziert werden, von denen 76 in Gegenwart von Bakterien in signifikant unterschiedlicher Menge vorlagen. Es waren fast gleichviele Proteine in niedrigeren Konzentrationen wie in höheren Konzentrationen gefunden. Die meisten dieser Proteine spielten eine Rolle bei der Zelladhäsion oder dem Zellmetabolismus. Kein Protein, das an der zellulären Immunität beteiligt ist, war unterschiedlich exprimiert. Dies zeigte, dass die Bakterien die Physiologie der Wirtszellen in erheblichem Maße beeinflussen konnten