Synthese von Donor-Substraten der 4-Amino-4-desoxy-L-arabinose Transferasen

Viele Gram-negative Bakterien verfügen über effiziente Abwehrmechanismen gegenüber dem Immunsystem der jeweiligen Wirtsorganismen. Grundlegende Funktionen übt in diesem Zusammenhang die äußere Membran der bakteriellen Zellwand aus, die zahlreiche negativ geladene Substituenten in Form von Säure- bzw. Phosphathältigen Kohlenhydratstrukturen aufweist. Diese Barrierewirkung der bakteriellen Zellmembran wird jedoch insbesondere durch entgegengesetzt (positiv) geladene Eiweißverbindungen (Peptide) des angeborenen Immunsystems überwunden, wogegen sich viele Bakterien wiederum durch Einbau positiv geladener Aminozucker wie Aminoarabinose schützen und somit resistent werden. Von besonderer Bedeutung sind diese Membranmodifikationen in den pflanzenpathogenen Burkholderien, die landwirtschaftlich genutzt werden, aber in den letzten Jahren zunehmend Bedeutung als Humanpathogene erlangt haben. Die Besiedlung der Lunge mit Burkholderia cepacia führt zum drastischen Verfall der Lungenfunktion und in Form des Cepacia-Syndroms zu einem letalen Verlauf der Infektion. Die Multiresistenz vieler klinischer Isolate gegen die meisten gängigen Antibiotika ist eine weitere Besonderheit von Burkholderien. Die Enzyme, welche die Aminoarabinose auf das bakterielle Lipopolysaccharid übertragen sind noch sehr unvollständig charakterisiert, ebenso die an der Biosynthese beteiligten Enzyme die in mehreren Schritten die Aktivierung der Aminoarabinose in Form langkettiger Zuckerphosphat-Lipide als Substrat bewirken. Nachdem diese Verbindungen nur in sehr geringen Mengen aus natürlichen Quellen isolierbar sind, sollen durch chemische Synthese die nativen Substrate, Inhibitoren und eine Reihe von Fluoreszenz-markierten Derivaten hergestellt werden. Mit den Syntheseprodukten sollte auch zu klären sein, ob ein oder zwei unterschiedliche Enzyme die Aminoarabinose übertragen. Die zentralen Syntheseschritte sollen zunächst an kürzeren, einfachen Lipiden etabliert und in der Folge auf die komplexen lang-kettigen Lipide (Heptaprenol und Undekaprenol mit 35 bzw. 55 Kohlenstoffatomen) übertragen werden. Darüber hinaus sind auch Kohlenstoffverknüpfte Derivate (C- Phosphonate und monofluorierte C-Phosphonate) geplant, die den Aminoarabinose-Transfer blockieren sollen und damit die Wirksamkeit der antimikrobiellen Peptide wiederherstellen könnten. In Kooperation mit Miguel Valvano (Queens University Belfast, UK), der über langjährige Forschungserfahrung in der Mikrobiologie und Genetik von Burkholderien verfügt, sollen die in Wien synthetisierten Verbindungen getestet werden. Geeignete Inhibitoren und Substrate sollen in der Folge in Bindungsstudien (Kernresonanzspektroskopie, Röntgenkristallographie) eingesetzt werden. Insgesamt ist ein wesentlicher Beitrag zum Verständnis der Übertragung von Phospholipid-Zuckern auf die bakteriellen Akzeptorsubstrate mit weitreichenden Implikationen in der künftigen Therapie von multiresistenten Burkholderien und anderen Gram-negativen Pathogenen zu erwarten.

Viele Gram-negative Bakterien verfügen über effiziente Abwehrmechanismen gegenüber dem Immunsystem der jeweiligen Wirtsorganismen. Im Zusammenhang mit der zunehmenden Antibiotikaresistenz sind es vor allem negativ geladene Gruppen in der äußeren Membran der bakteriellen Zellwand, die von Komponenten des angeborenen Immunsystems und einigen Antibiotika gebunden werden, wogegen sich Bakterien durch Maskierung dieser Ladungen durch den Einbau positiv geladener Aminozucker wie Aminoarabinose schützen und somit resistent werden. Die Übertragung der Aminoarabinose durch die entsprechenden Transferasen ist noch wenig untersucht, zumal der für den Transfer erforderliche aktivierte Zucker in Form langkettiger Zuckerphosphat-Lipide nur in sehr geringen Mengen isoliert werden kann. Im Rahmen des Projekts wurde daher die chemische Synthese für diese Donorsubstrate eingesetzt, mit der Fragestellung ob auch vereinfachte und kürzere Lipid-Ketten von den Transferasen akzeptiert werden. Dabei wurde eine Substanzbibliothek mit sieben Phosphodiester-verknüpften Aminoarabinose-Donoren hergestellt aber auch Verbindungen, welche eine Kohlenstoff-Bindung am aktiven Zentrum des Kohlenhydrats aufweisen. Letztere Verbindungen können enzymatisch nicht umgesetzt werden, eignen sich daher als Inhibitoren der Transferreaktion und könnten somit die Wirksamkeit bestimmter Antibiotika wieder herstellen. Im Rahmen einer Kooperation mit der Gruppe von Miguel Valvano an der Queens University in Belfast wurde die Transferase aus pathogenen Burkholderien in Escherichia coli exprimiert und als Membranpräparation mit den Syntheseprodukten und einem Lipopolysaccharid aus E. coli als Akzeptor getestet. Die enzymatische Reaktion wurde über Dünnschichtchromatographie verfolgt und die Produkte mittels hochauflösender Massenspektrometrie strukturell charakterisiert. Von allen Syntheseprodukten konnte der Glykosyltransfer ausschließlich mit dem -Neryl Derivat beobachtet werden - was die allgemein hohe Spezifität von Glykosyltransferasen bestätigt - wobei mono- und disubstituierte Produkte gebildet wurden. Der Ort der Substitution an den 1- und 4'-Phosphaten des Lipid A Teils im Lipopolysaccharid-Akzeptor wurde sodann nach Säurehydrolyse der Kdo-Einheiten identifiziert. Mit dem einfachen kurzkettigen Donor steht nunmehr ein gut zugängliches Donorsubstrat zur Verfügung mit dem in der Folge biochemische Untersuchungen an weiteren Aminoarabinosetransferasen, Lipopolysaccharid-Akzeptoren sowie Bindungsstudien (Kernresonanzspektroskopie, Röntgen-strukturuntersuchungen) ermöglicht werden. Insgesamt ist ein wesentlicher Beitrag zum Verständnis der Übertragung von Phospholipid-Zuckern auf die bakteriellen Akzeptorsubstrate mit möglichen Implikationen in der künftigen Therapie von multiresistenten Burkholderien und anderen Gram-negativen Pathogenen gelungen.