Struktur-Funktionsanalyse von humanem Afamin

Das Glykoprotein Afamin ist ein Biomarker im Blutplasma dessen erhöhte Werte mit praktisch allen Riskofaktoren assoziiert sind, die unter dem metabolischen Syndrom zusammengefasst wer- den: Erhöhte Blutzucker- und Blutfettspiegel, Übergewicht, Bluthochdruck, sowie Präeklampsie (erhöhtes Risiko für Frühgeburten). Trotz der Assoziation von Afamin mit weitverbreiteten Symp- tomen und Risikofaktoren für Zivilisationskrankheiten ist nur sehr wenig über seine Funktion be- kannt. Studien in unserer Arbeitsgruppe an der Medizinischen Universität Innsbruck haben gezeigt dass es sich bei Afamin primär um einen vielseitigen Transporter von schwer wasserlöslichen Mo- lekülen (darunter Vitamin E) handelt. Praktisch nichts ist bekannt über Details der molekularen Struktur und ihrem Zusammenhang mit der Funktion dieses wichtigen Biomarkers und Transpor- ters. Ziel unseres international integrierten Projektes ist daher die molekulare Struktur von Afamin mittels Röntgenstrukturanalyse aufzuklären. Die detaillierte Kenntnis der molekularen Struktur er- laubt weitreichende Einsichten und Entdeckungen, die wichtige Fragen zu vermuteten als auch zu noch unbekannten Funktionen beantworten: Wie sieht Afamin im Detail aus? Wodurch unterschei- det es sich von bekannten, ähnlichen Transportproteinen wie Albumin? Welche aktiven Bindungs- taschen können wir in Afamin identifizieren? Welche Klassen von Molekülen könnten dort binden? Welche Moleküle binden bereits natürlich an Afamin, und welche können wir experimentell mit Afamin komplexieren? Kann Afamin ebenfalls wie Albumin therapeutisch relevante Wirkstoffmole- küle im Blutstrom abtransportieren und daher ihre Wirksamkeit beeinflussen? Zur Röntgenstrukturaufklärung müssen kleine Kristalle von Afamin in winzigen Lösungs- Tröpfchen gezüchtet werden. Wir haben erhebliche Fortschritte bei der notwendigen Expression, Reinigung, und Kristallisation von Afamin-Varianten erzielt. Noch nicht optimierte Kristalle von Afamin haben einen Streudatensatz bis 3.2 Å geliefert, Afamin-Antikörper Fragmente als Gerüst- moleküle haben erste Streuung gezeigt, und Afamin-Antikörper-Komplexe haben erste Kristalle gebildet. Aus den Röntgenstreudaten der Kristalle wird ein detailliertes Strukturmodell als Basis für bioinformatische Analysen der Bindungstaschen und Ligandenbindung erstellt. Diese Methoden haben wir unter Verwendung eines Homologie-Modells (basierend auf der verwandten Albumin- Struktur) getestet und eine-Tocopherol (Vitamin E) als auch multiple potenzielle sekundäre hydrophobe Bindungstaschen identifiziert. Die tatsächliche experimentelle Afamin-Struktur wird erlauben, wichtige funktionelle, potentiell wirkstoff-bindende Bindungstas- chen zu identifizieren, und in Folgeexperimenten experimentell zu verifizieren. Die Analyse der molekularen Struktur von Afamin und seiner Komplexe mit niedermolekularen Liganden ist hervorragend geeignet, den Ursprung seiner Funktionsvielfalt zu enthüllen. Sie er- möglicht kritische Bewertung seiner Transporteigenschaften, und ultimativ die Abschätzung ob und wie Afamin therapeutisches Potential besitzt. Die Ergebnisse aus dieser Studie werden völlig neu- artig und von signifikanter Bedeutung sowohl für die Strukturbiologie als auch für die biomedizini- sche Atherosklerose-Forschungsgemeinde sein.

Strukturgeleitete Untersuchungen am humanen Glykoprotein Afamin enthüllen seine struktu-relle Plastizität und Multifunktionalität. Das Glykoprotein Afamin ist ein Biomarker, dessen erhöhte Werte im Blutplasma mit praktisch allen Riskofaktoren assoziiert sind, die unter dem metabolischen Syndrom zusammengefasst werden: Erhöhte Blutzucker- und Blutfettspiegel, Übergewicht, Bluthochdruck, sowie Präeklampsie (erhöhtes Risiko für Frühgeburten). Trotz der Assoziation von Afamin mit weitverbreiteten Symptomen und Risikofaktoren für Zivilisationskrankheiten war nur sehr wenig über seine Funktion und praktisch nichts über seine molekulare Struktur bekannt. Durch Studien an der Medizinischen Universität In-nsbruck war jedoch vermutet, dass es sich bei Afamin primär um einen vielseitigen Transporter von schwer wasserlöslichen Molekülen handelt. Details der molekularen Struktur und ihr Zusammen-hang mit der Funktion dieses wichtigen Biomarkers wurden durch dieses FWF geförderte Projekt aufgeklärt. Die detaillierte Kenntnis der molekularen Struktur erlaubte uns weitreichende Einsichten und neue Entdeckungen, die wichtige Fragen zur vermuteten Funktion beantwortet haben und auch vollkommen neue Funktionen aufgezeigt haben. Die Bestimmung der molekularen Struktur mittels Röntgenkristallographie war enorm schwierig da das Afamin Molekül höchst flexibel ist und nur sehr ungern die geordneten Kristalle formt, die für Röntgenstrukturanalyse unbedingt notwendig sind. Hunderte von winzigen Afamin-Kristallen muss-ten gezüchtet werden und an einer der leistungsfähigsten Strahlenquellen Europas, am ESRF Syn-chrotron in Grenoble, untersucht werden. Durch Einsatz neuester und technisch anspruchsvollster experimenteller Methoden konnten wir detailreiche Strukturmodelle erstellen, welche die Bindungs-taschen und darin gebundenen Moleküle präsentieren. Unsere Strukturanalyse zeigte, dass Afamin eine Vielzahl von verschieden Konformationen einnehmen kann, um verschiedene, nur schwer was-serlösliche Moleküle in tiefen hydrophoben Bindungstaschen zu transportieren. Besonders interes-sant und unerwartet war die Entdeckung, dass Afamin auch hydrophobe Signalproteine transportie-ren kann, die in der interzellulären Kommunikation wichtig sind. Dies wiederum ist ein Hinweis da-rauf, dass Afamin ursächlich an den Krankheitsbildern des metabolischen Syndroms beteiligt sein kann. Wir haben ebenfalls entdeckt, dass Afamin in der Lage ist, im Blutkreislauf Gadoliniumverbin-dungen, die als Kontrastmittel in der Magnetresonanztomografie eingesetzt werden, zu transportie-ren. Die von uns erstellten experimentellen Strukturmodelle von Afamin sind öffentlich für alle Forscher zugänglich und erlauben erstmals eine kritische und rationale Untersuchung seiner Transporteigen-schaften sowie eine Abschätzung ob und wie Afamin therapeutisches Potential besitzt. Die Ergeb-nisse unserer Studie sind völlig neuartig und von signifikantem Interesse für die Strukturbiologie und für die biomedizinische Forschungsgemeinde.