Substraterkennung durch picornavirale Proteasen L und 2A

Um die Replikation des viralen Genoms und die Synthese von neuen infektiösen Partikeln zu gewährleisten, müssen Viren mit den Makromolekülen und Organellen der Zelle wechselwirken. Die Beeinflussung der Proteinsynthese ist für RNA Viren von entscheidender Bedeutung, damit das RNA Genom in der Umgebung der Zelle effizient translatiert werden kann. Zusätzlich verhindert die Inhibition der Proteinsynthese von zellulären mRNAs die Produktion von Proteinen des angeborenen Immunsystems, sodass die Viren die Wirtsverteidigung überwinden können. Diese Wirkung kann verstärkt werden, indem einerseits die Aktivation von NF-B gehemmt wird und somit Gene für Entzündungen nicht transkribiert werden können. Dieses Projekt setzt die Untersuchung von zwei Proteinen der Picornaviren fort: der Leader Proteinase (Lpro) vom Maul-und-Klauenseuche Virus und der 2A Proteinase (2Apro) von Enteroviren (zB Coxsackievirus und Rhinovirus), welche die Proteinsynthese der Zelle so wie das angeborene Immunsystem beeinflussen. Des Weiteren fokussieren wir uns auf die Erforschung der Struktur des Wirtstranslationsinitiationsfaktors eIF4G, welches von diesen beiden Proteasen spezifisch gespalten wird. Mithilfe von Kernspinresonanzspektroskopie zeigten wir, dass ein kurzes Fragment des eIF4G sowohl mit Lpro und 2Apro sowie mit dem zellulären Protein eIF4E, welches die zelluläre mRNA zum Ribosom bringt, interagiert. Außerdem wird ein stabiler dreifacher Komplex zwischen eIF4GII und den picornaviralen Proteasen nur geformt wenn eIF4E anwesend ist. Unerwarteterweise interagiert Lbpro direkt mit eIF4GII und eIF4E, während die 2Apro sogar einen stabilen Komplex mit eIF4E, in Abwesenheit von eIF4GII, bildet. Daraus schließen wir, dass ein dreieckiger dreifacher Komplex gebildet wird, welcher aktive Translationsfaktoren zum Ziel hat. Die unterschiedliche Protein-Protein Interaktion von Lbpro und 2Apro deutet darauf hin, dass sich der Mechanismus mit eIF4GII/eIF4E zu interagieren unterschiedlich entwickelt hat. Auf dieser Information basierend, wollen wir den genauen Mechanismus untersuchen, mit dem die Proteasen eIF4GII, eIF4E oder den eIF4GII/eIF4E Komplex anzielen und wie sich dieser Mechanismus unterscheidet. Die Interaktion dieser Proteine ist ein wichtiger, häufig in Krebszellen gestörter Kontrollpunkt im zellulären Wachstum. Daher werden die Ergebnisse auch für Wachstumskontrolle in Säugetierzellen relevant sein. Mit Lpro werden wir mit Hilfe einer neuen Technik nach weiteren Substraten in der infizierten Zelle suchen. Außerdem wollen wir erforschen, ob Lpro ein Wirtsprotein deubiquitinieren kann, um das Immunsystem zu untergraben. Im Hinblick auf die Entwicklung eines Inhibitors werden wir, mithilfe von NMR, sowohl die Selbst-Prozessierung, als auch die Substratbindungsstelle der enteroviralen 2Apro untersuchen.

Die Familie der Picornaviren enthält wichtige menschliche und tierische Krankheitserreger wie Poliovirus (PV), menschliches Rhinovirus (HRV) und Maul- und Klauenseuche-Virus (FMDV). Impfstoffe wurden erfolgreich zur Bekämpfung von Infektionen durch PV und FMDV eingesetzt. Für HRVs sind jedoch keine Impfstoffe erhältlich. Darüber hinaus können die FMDV-Impfstoffe nur unter bestimmten Bedingungen verwendet werden. Die PV-Impfstoffe sind möglicherweise nicht ausreichend wirksam, um den Abschluss des PV-Austrottungsprogramms ohne Unterstützung von antiviralen Medikamente sicherzustellen. Hier untersuchten wir zwei potenzielle Kandidaten für antivirale Medikamente für die oben genannten Viren, die Proteinase 2Apro von HRV und die Leader-Proteinase (Lpro) von FMDV. Das Projekt hatte zwei Ziele. Das erste bestand darin, das 2Apro aus zwei genetischen Gruppen menschlicher Rhinoviren zu untersuchen. Die 2Apro aus diesen Gruppen zeigen auf Aminosäureebene nur eine Identität von 50% oder weniger und besitzen unterschiedliche Spezifitäten. Untersuchungen zu den Unterschieden wurden durch die Unfähigkeit behindert, ein 2Apro aus der genetischen Gruppe B zu exprimieren und zu reinigen. In diesem Projekt haben wir dieses Problem überwunden und konnten die Aktivität von 2Apro aus beiden Gruppen auf verschiedenen Substraten untersuchen. Obwohl beide 2Apro von menschlichen Rhinoviren stammen, haben die 2Apro tatsächlich unterschiedliche Aktivitäten gegenüber zellulären Substraten, was impliziert, dass Viren der beiden Gruppen unterschiedlich mit der infizierten Zelle wechselwirken. Trotzdem konnten wir zuvor ein Molekül entwerfen, das beide Enzyme hemmen kann. In diesem Projekt ist es uns gelungen, die molekulare Struktur des Enzyms aus der genetischen Gruppe A mit dem Inhibitor zu bestimmen. Dadurch können spezifischere und aktivere Verbindungen gegen diese viralen Enzyme entwickelt werden. Ein Vergleich mit Modellen des Poliovirus-Enzyms legt nahe, dass das mit Rhinoviren gewonnene Wissen auch auf Poliovirus anwendbar sein wird. Das zweite Ziel bestand darin, unser Verständnis des Mechanismus und der Spezifität des Lpro-Enzyms zu nutzen, um seine Rolle bei der Unterdrückung der angeborenen Immunität zu untersuchen und die Architektur von Ubiquitin-Modifikationen zu untersuchen. Zusammen mit Kollegen in Utrecht und Cambridge konnten wir zeigen, dass das Lpro von FMDV die angeborene Immunantwort aktiv stört, indem es das angeborene Immunmarkerprotein ISG15 von Proteinen entfernt. Darüber hinaus hinterlässt die Entfernung von ISG15 ein spezielles Aminosäuresignal, mit dem das Vorhandensein einer FMDV-Infektion nachgewiesen werden kann. Wir haben auch gezeigt, dass das Lpro spezifisch bestimmte Schlüsselproteine des angeborenen Immunsystems abbaut, die auf das Vorhandensein einer Infektion hinweisen. Mit unserem Verständnis des Lpro konnten wir auch seine Spezifität modifizieren, damit es das verwandte Markerprotein Ubiquitin besser verarbeiten kann. Mit dem modifizierten Enzym könnten wir untersuchen, wie Ubiquitin an ein wichtiges Protein bei der Parkinson-Krankheit namens Parkin gebunden ist, und unser Verständnis dieses wichtigen Moleküls verbessern. Dieses Ergebnis zeigt, wie die Untersuchung eines lebenswichtigen viralen Enzyms das Verständnis menschlicher Krankheiten erhöhen kann.