Eine elektrophysiologische Analyse der Konformationen des Serotonin Transporters

Die Transporter für die Monoamine Dopamin, Serotonin und Noradrenalin sind wichtige therapeutische Angriffspunkte für Arzneimittel, die gegen Depressionen eingesetzt werden. Sie sind allerdings auch die Angriffspunkte für suchterregende Drogen wie Kokain und Amphetamin. Man bezeichnet die Monoamin Transporter als sekundär aktiv weil sie von Natriumionengradienten energetisch angetrieben werden und man rechnet sie der SCL6 (solute carrier) Genfamilie zu. Ihre Aufgabe ist es extrazelluläres Monoamin, das vorher mittels Vesikeln ausgeschüttet wurde, zurück in die Zelle zu transportieren. Das passiert zum Beispiel in den Synapsen. Es sind einige Polymorphismen und de-novo Mutationen bekannt die in kodierenden und regulatorischen Bereichen der entsprechenden Gene auftreten. Manche dieser Veränderungen stehen im Verdacht mit psychiatrischen und neurologischen Erkrankungen in einem ursächlichen Zusammenhang zu stehen. Monoamin Transporter funktionieren wahrscheinlich so, dass sie den Zugang für Substrate und Kosubstrate immer nur von einer Seite erlauben. Zuerst bindet der Transporter Substrate die sich außerhalb der Zelle befinden. Darauf folgend klappt der Transporter um und entlässt das gebundene Substrat in die Zelle. Der genaue Mechanismus ist allerdings unbekannt. Wenn ein Transporter sich in Folge einer Mutation abnorm verhält muss das nicht heißen, dass es zu leicht erkennbaren Veränderungen kommt. Die Feststellung kleiner Veränderungen kann schwierig sein, weil die verwendeten diagnostischen Verfahren zu ungenau sind. Jedoch können auch kleine Veränderungen in der Arbeitsweise der Transporter Erkrankungen verursachen. Deshalb ist es wichtig Techniken zu finden die eine bessere Auflösung erlauben. Elektrophysiologische Methoden könnten dafür geeignet sein, da sie in der Lage sind die Funktion eines Transporters in Echtzeit zu messen. Die Transporter regieren unter anderem auf Substrate so, dass sie wenn die Substrate vorhanden sind Ionenströme durch lassen. Damit man diese Ströme diagnostisch verwenden kann muss man allerdings zuerst verstehen wie sie mit der Transportaktivität im Zusammenhang stehen. Deshalb ist es ein Ziel dieses Projektes das Verständnis für diesen Zusammenhang zu verbessern. Hier gibt es aber noch viele Unklarheiten. Diese Unklarheiten müssen beseitigt werden bevor man in der Lage ist mittels der Transporter-ströme Defekte zu identifizieren. Ein großes Problem ergibt sich dadurch, dass unverstanden ist wie die Chlorid-Ionen und die Kalium-Ionen den Transportprozess beeinflussen. Beide Ionen sind sehr wichtig, weil ohne sie kein Transport von Serotonin über den Serotonintransporter stattfindet. Es gibt widersprüchliche Daten bezüglich der Rolle des Chlorid Ions und des Kalium Ions. Im Widerspruch zur klassischen Sichtweise gibt es Anhaltspunkte dafür, dass Chlorid nicht kotransportiert wird und dass kein Kalium Antiport stattfindet . In diesem Projekt soll deshalb diesen Fragen nachgegangen werden mit dem Ziel ein Modell zu erstellen, das die Funktion des Transporters gut beschreiben kann. Ein derartiges Modell ist Voraussetzung dafür, dass die Defekte eines veränderten Transporters verstanden werden können.

Die wichtigsten Ergebnisse dieses Projekts sind, (i) dass es gelungen ist die Geschwindigkeit der relevanten Reaktionschritte zu messen, die notwendig dafür sind, dass der Serotonin-transporter seine Aufgabe - nämlich Serotonin in Nervenzellen aufzunehmen - erfüllt, (ii) zu beweisen, am Beispiel des Dopamine- transporters, dass es möglich ist die Aktivität eines Transporters pharmakologisch zu erhöhen (iii) und zu zeigen, dass Zellen die den Serotonin-transporter in der Zellmembran tragen ein geeignetes Modellsystem sind, mit dem sich demonstrieren lässt, dass das Binden von Molekülen an Membranproteine mit elektrophysiologischen Methoden detektiert werden kann. Um das Letztere zu erreichen wurden Messungen der elektrischen Membrankapazität durchgeführt. Die Aufgabe von Serotonin- und Dopamine-transportern ist es die Neurotransmitter Serotonin und Dopamine wieder in jene Nervenzellen aufzunehmen, die diese Moleküle vorher ausgeschüttet haben. Die beiden Transporter sind jedoch auch wichtige Zielstrukturen die pharmakologisch genützt werden, um Krankheiten wie etwa Depressionen und Angststörungen zu behandeln. Bisher jedoch wurden in der Therapie nur Arzneimittel angewandt, die den Transporter entweder blockieren oder solche die vom Transporter statt den körpereigenen Molekülen (Serotonin und Dopamine) durch die Zellmembran transportiert werden. Denkbar ist jedoch, dass Substanzen die an sogenannte allosterische Bindungstellen binden (abseits der Bindungstelle für Serotonin und Dopamine) den Transporter auf eine ganz andere Art und Weise beeinflussen können und dass das neue therapeutische Möglichkeiten eröffnet. Um zu verstehen welche alternativen pharmakologischen Beeinflussung es gibt, ist es jedoch notwendig zu beschreiben wie diese Transporter im Detail funktionieren. Ziel dieses Projektes war es deshalb, alle Zustandsveränderungen eines aktiven Transporters zu identifizieren und die Übergangsgeschwindigkeiten zwischen diesen Zuständen zu messen. Zur Bestimmung der Übergangsgeschwindigkeiten haben wir elektrophysiologische Methoden verwendet, weil diese die notwendige Zeitauflösung haben. Mit der erhaltenen Information haben wir ein mathematisches Modell erstellt, das in der Lage ist die Funktion des Serotonin-transporters genau zu beschreiben und Voraussagen über das Verhalten des Transporters unter experimentell nicht getesteten Bedingungen zu treffen. Ein wichtiges Ergebnis war auch, dass wir zeigen konnten, dass ein Molekül -in diesem Falle Zink- den Dopamine-transporter schneller transportieren lässt. Zuvor war es unklar ob sich ein solcher Effekt pharmakologisch realisieren lässt. Der Umstand, dass es möglich war den Transporter mit Zink zu beschleunigen, lässt hoffen, dass man Arzneimittel wird finden können die die Monoamine-transporter auf ähnliche Art und Weise beeinflussen. Solche Arzneimittel könnten bei der Behandlung von Suchtmittelabhängigkeit und bei der Behandlung von Schizophrenie Anwendung finden. Im Zuge unserer elektrophysiologischen Analyse des Serotonin-transporters haben wir eine neue Methode etablieren können mit der man das Binden von geladenen Molekülen an Membranproteine mit hoher Zeitauflösung und ohne das Molekül "etikettieren" zu müssen messen kann. Obwohl wir diese Methode am Beispiel des Serotonin transporters vorführen ist sie nicht auf dieses Protein beschränkt. Zukünftige Anwendungsgebiete könnten membranständige Rezeptoren sein für die Untersuchungsmethoden, die hohe Zeitauflösung bieten, fehlen.