Nano Dielektrische Spektroskopie von Ionenkanälen

Viele physiologische Prozesse auf zellulärer und subzellulärer Ebene basieren auf elektrostatischen Interaktionen und dem Transport von Ionenladungen. Ein besonders interessanter Aspekt sind die Leitungseigenschaften von Ionenkanälen in der Zellmembran, welche oft mit der patch-clamp Methode untersucht werden. Forschung in diesem Bereich finden wichtige Anwendungen in der Pharmakologie usw. Für existierende patch-clamp Geräte ist jedoch die elektrische Bandbreite limitiert, sodass Ströme im Zeitbereich unter 1s kaum messbar sind. Um auch schnellere Prozesse aufzuzeichnen, kann die Leitung durch Ionenkanäle alternativ auch mit Dielektrischer Spektroskopie in der Frequenzdomäne gemessen werden. So können aktuell elektrische Messungen bis GHz oder sogar höhere Frequenzen durchgeführt werden. Dies ist ein Bereich in dem auch dielektrische Relaxationsprozesse von Strukturen im Nanometerbereich von z.B. Proteinen oder Ionenkanälen auftreten und welcher ebenso für elektrische Rastersondenmikroskopie zugänglich ist. In diesem Projekt werden die Stärken von Breitband Dielektrischer Spektroskopie (0.5 MHz bis 20 GHz) mit Rasterkraftmikroskopie kombiniert, mit dem Ziel eine neue Technik, die Nano Dielektrische Spektroskopie, in der Biophysik zu etablieren. Die entwickelte Technik wird dazu genutzt werden, um die Hoch-Frequenz-Leitfähigkeit von rekonstituierten KcsA-Kaliumkanälen in Lipidmembranen zu messen. Hohe Sensitivität für die elektrischen Eigenschaften des Ionenkanals wird durch die Nano-Sonde des verwendeten Mikroskops erreicht, welche elektrische Felder sehr effektiv in den Ionenkanal applizieren kann. Die Leitfähigkeit wird gemessen, indem dielektrische Spektren im Frequenzbereich von 0.5 MHz - 20 GHz aufgenommen werden. Dies eröffnet die Möglichkeit Ionenkanalleitfähigkeiten bei Frequenzen zu messen, die dem typischen Zeitbereich entsprechen, den ein Ion braucht, um einen Kanal zu passieren (etwa 1-100ns). So könnten entsprechende Resonanzeffekte sichtbare werden, wie sie auch in der Literatur postuliert wurden. Von Messungen unter verschiedenen externen Bedingung (z.B. pH, Inhibitoren) werden neue Erkenntnisse über den Mechanismus der Ionenleitung in Kanälen in einer völlig neuen Zeitskale erwartet. Weitere Untersuchungen zum Steuerungsprozess von spannungssensitiven KvAP Kanälen werden mit dem Ziel durchgeführt schnelle, strukturelle Änderungen des Spannungssensors zu messen, welche mit patch-clamp nicht zugänglich sind. In einem zweiten Projektteil wird die Ionenkanalaktivität wie in patch-clamp direkt auf einzelnen Zellen gemessen, hier jedoch auf kleineren Bakterienzellen und bei hohen Frequenzen (>MHz). Dielektrische Spektren werden aufgenommen, um selektiv Signalbeiträge der Zellmembran und des Cytosols extrahieren zu können. Die Aktivität von KcsA Kanälen wird bei diesen Experimenten wieder durch den pH Wert eingestellt. Die Vorteile von direkten Zellmessungen liegen z.B. in der einfacheren Probenpräparation usw. In zukünftigen Projekten können die hier entwickelten Einzelzellspektroskopie-techniken auch dazu verwendet werden, um den Wirkmechanismus von Arzneien auf einzelne Bakterien anhand der entsprechenden Änderungen im dielektrischen Spektrum zu studieren.

Die Interaktion von biologischer Materie mit elektrischen Feldern ist wichtig für viele grundlegende elektrophysiologische Funktionen wie z.B. den selektiven Transport in Ionenkanälen. Dieser Prozess findet auf zellulärer Ebene statt - konkret in der Zellmembran und damit auf der Mikrometer- oder Nanometerskala. Lokale elektrische Messungen auf dieser Längenskala sind sehr anspruchsvoll, und besonders schnelle, elektrische Prozesse sind daher schwer zu beobachten und zu untersuchen. In diesem Projekt wurden zwei neue Methoden entwickelt, die es erlauben, elektrochemische Ströme und elektrische Bewegungen von Ladungen innerhalb einer Zellmembran mit Nanometer Auflösung zu erfassen. Die erste Technik, die als elektrostatische Breitband-Kraftmikroskopie bezeichnet wird, kann die Bewegung von Ladungen und Dipolen in einem breiten Frequenzbereich (von DC bis zu GHz-Frequenzen) messen und zur lokalen Charakterisierung der dielektrischen Eigenschaften von biologischen und anderen mikro- und nanoskaligen Objekten verwendet werden. Aus funktioneller Sicht spielt die Frequenzabhängigkeit der dielektrischen Permittivität eine wesentliche Rolle, da sie bestimmt, wie schnell die Dipole, die mit den integralen molekularen Proteinstrukturen verbunden sind, die Konformation in Abhängigkeit von einem externen elektrischen Feld verändern. Es wird vermutet, dass die Mobilität der Dipole, die die Funktion des Proteins selbst ermöglicht, stark vom umgebenen Wasser abhängig ist. Durch Experimente an bakteriellen Proteinmembranen konnte in diesem Projekt gezeigt werden, dass die dielektrische Antwort tatsächlich stark von der Wasserumgebung des Proteinmoleküls abhängt. Zudem wurden die für die Proteinuntereinheiten charakteristischen Dipolbewegungen beobachtet. Abgesehen von der Bedeutung der Dipoldynamik für die biophysikalische Funktion des Proteins können die intrinsischen Zeitkonstanten, mit denen strukturelle Veränderungen in Proteinen auftreten, auch als dielektrischer Fingerabdruck verwendet werden. Bei THz und höheren Frequenzen ist die Identifizierung spezifischer Materialien anhand ihres "dielektrischen" oder "chemischen" Fingerabdrucks nachgewiesen worden. In diesem Projekt wurde gezeigt, dass der dielektrische Fingerabdruck und die Untersuchung von nanoskaligen, dielektrischen Relaxations- und Resonanzprozessen auch bei niedrigeren Frequenzen zugänglich sind. Die zweite im Projekt neu entwickelte Technik ist das elektrochemische Rastermikrowellenmikroskop (ec-SMM), das die lokale Messung ionischer und elektrochemischer Ströme bei GHz-Frequenzen ermöglicht. Wie in diesem Projekt gezeigt wurde, kann das SMM die dielektrischen und leitfähigen Eigenschaften einer breiten Palette von Materialien im Nanobereich messen - angefangen von Bakterien bis hin zu Halbleitern. Abgesehen davon hat es die Fähigkeit, auch atomar kleine elektrische Merkmale im Untergrund der untersuchten Probe zu identifizieren. Für die Messung der kleinen Ionenströme durch Ionenkanäle in Lösung war daher eine sorgfältige Anpassung der Technik erforderlich, die erfolgreich abgeschlossen wurde. Über dieses Projekt hinaus wird die Technik zudem ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung der lokalen Elektrochemie in Energiematerialien wie Lithium-Ionen-Batterien und in anderen Prozessen sein.