Molekulare Interaktionen von deregulierten Kinasekaskaden

Zelluläre Membranrezeptoren erkennen Umweltveränderungenund leiten den umgewandelten Signalimpuls, über räumlich und zeitlich organisierte Proteininteraktions- Netzwerke, in das Zellinnere weiter. Viele dieser Proteininteraktionen sind transient, andere treten nur in bestimmten zellulären Kontexten oder Entwicklungsstadien auf. Verschiedene Krankheiten, unter anderem Krebs, können als pathologische Veränderungen dieser Signalnetzwerke angesehen werden. Um zu Grunde liegende Mechanismen aufzuklären, sind Untersuchungen molekularer Interaktionen notwendig. Bisher wurden fast ausschließlich Momentaufnahmen von statischen Proteininteraktions-Netzwerkenbeschrieben. Wirstellen uns nun den Herausforderungen: (i) dynamische Verbindungen und involvierte Protein-modifikationen innerhalb dieser molekularen Signalschaltkreise zu analysieren, (ii) direkt die erkrankten Zellen oder Gewebe zu untersuchen, (iii) das Konzept von Proteininteraktions-Netzwerken durch Integration von post-translationalen Modifikationen, bioaktiven chemischen Molekülen und regulatorischen RNAs weiterzuentwickeln. Ausgehend von Kinasesignalwegen haben wir auf systembiologischer Basis eine Strategie entwickelt, um dynamische Proteininteraktionen zu untersuchen. In der Machbarkeitsstudie konnten wir, nach Rezeptoraktivierung, endogene cAMP-abhängige ProteinkinaseA (PKA)Komplexeaushumanen Osteosarkomzellen isolieren. Diese Netzwerkstudie ist die konzeptionelle Basis für das vorgelegte Projekt. Nun planen wir Kinasekomplexe direkt aus humanem Krebsgewebe (Glioblastom) oder aus einfachen, hoch proliferierenden Metazoen (Hydra) zu isolieren. Diese Strategie sollte es ermöglichen, detailreiche Informationen über den internen Status von proliferierenden Zellen, Geweben und Modellorganismen zu erhalten. Wir hoffen mit Kinasen interagierende Signalknoten zu identifizieren, die für Proliferation relevant sind. Nach den ersten Analysen mit Osteosarkomzellen glauben wir, neue Verbindungen zwischen Kinaseaktivitäten und Karzinogenese bzw. neurodegenerativen Erkrankungen entdeckt zu haben. Zum einen untersuchen wir inwieweit RNA-bindende Proteine, die mit der Entstehung von neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht werden, durch Kinasen reguliert werden. Zum anderen überprüfen wir die Mitwirkung von PKA Aktivitäten am Zusammenspiel von Rezeptorkaskaden bei der Karzinogenese. Die Experimente zielen darauf ab, die Kernkomplexe von Kinasekaskaden in verschiedenen Krebsformen zu identifizieren (Osteosarkom und Glioblastom). Die darauf basierenden Signalnetzwerke solltenmechanistischeDetails über Signalknotenpunkte offenlegen. Unsere Untersuchungen sollten neue Möglichkeiten eröffnen, um fehlgeschaltete Signalweiterleitung zu unterbinden und letztlich zu neuen Ansätzen in der Krebstherapie führen.

Zelluläre Signalübertragung ist abhängig von der Ausbildung von definierten molekularen Wechselwirkungen. An der Plasmamembran erkennen, konvertieren, verstärken und senden mehr als 800 G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) eingehende Signale in das Zellinnere. Diese Informationen werden über Signalplattformen an funktionell interagierende Signalenzyme und deren Substrate weitergeleitet. Die Liste der Hormon-- Signalkaskaden, die das cAMP-abhängige Proteinkinase-A System (PKA) verwenden, ist umfassend. Es ist daher notwendig, dass die Spezifität, die Dauer und die Intensität der Kinase-Reaktionen räumlich und zeitlich begrenzt werden. Diese Funktion übernehmen Strukturproteine, indem sie das Wechselspiel von Second-Messenger-Sensoren, Aktivatoren, Effektoren und Kinase- substraten in subzellulären Nanodomänen koordinieren. Sogenannte A-Kinase Ankerproteine (AKAPs) fungieren hierbei als physikalische Verbindung zwischen Rezeptoren und den verschiedenen molekularen Schaltern. Wir haben im Zuge eines Proteomics-Screens die überraschende Entdeckung gemacht, dass ein GPCR (=Gpr161), der im primären Zilium lokalisiert ist, AKAP Funktionen besitzt. Wir konnten die funktionelle Wechselwirkung zwischen Gpr161 und PKA bestätigen. Interessanterweise zeigen strukturelle Analysen, dass diese Wechselwirkung für regulatorische Typ-I PKA-Untereinheiten (RI) absolut spezifisch ist. In Experimenten mit Zebrafisch-Embryonen konnten wir zeigen, dass Gpr161-Rezeptoren RI Untereinheiten in die primären Zilien rekrutieren und dadurch die Hedgehog-Signalübertragung entscheidend beeinflussen. Die Mechanismen, die die Ziliogenese steuern, wurden eingehend untersucht. Wir haben dabei entdeckt, dass cAMP-Erhöhung den Ziliumabbau fördert. In diesem Zusammenhang konnten wir einen für die Ziliogenese essentiellen multimeren Proteinkomplex identifizierten, der zwei Kinasen und das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) umfasst. Darüber hinaus haben wir den Effekt von PKA-Patientenmutationen und post- translationalen Modifikationen auf PKA-Funktionen untersucht. In PPI-Reporteranalysen und Phospho-Proteomics-basierten Ansätzen haben wir neue Mechanismen der PKA-Regulation identifiziert. Zudem konnten wir zeigen, dass RAF Inhibitoren PPI der onkogenen RAS-RAF- ERK-Signalwege verändern. Insgesamt präsentieren wir neue Erkenntnisse, wie Kinase- komplexe durch post-translationale Modifikationen und Medikamenten-bindung funktionell verändert werden. Wir glauben, dass die Kenntnis des molekularen Mechanismus der Kinase- regulation und Inhibition für die Entwicklung von neuartigen Kinase-inhibitoren relevant werden könnte.