Freisetzung des Viralen Genoms: Wo und Wann?

Enteroviren, eine grosse Gattung wichtiger tierischer und menschlicher Pathogene innerhalb der Familie Picornaviridae ändern ihre 3D-Struktur während sie in die Zelle aufgenommen werden. Dies bereitet den Austritt der genomischen RNA aus dem Virion in das Zytoplasma vor, wo sie letztendlich vermehrt und neue Viren gebildet werden. In unseren kürzlich durchgeführten Arbeiten mit dem Protoyp eines Schnupfenvirus Spezies A (HRV-A2) fanden wir, dass nach der Umwandlung des nativen Virus in ein subvirales A-Partikel durch den sauren endosomalen pH zehn Minuten vergehen, bis das Genom (beginnend mit dem poly-(A) Trakt) das Viruskapsid verläßt. Daraus ergibt sich die Frage was während dieser Zeit geschieht. Es ist möglich, dass das virale Kapsid und/oder die Nukleinsäure zusätzliche Konformationsänderungen oder zelluläre Faktoren benötigen um den Austritt des Genoms zu initiieren. Es ist ebenfalls möglich, dass das subvirale Partikel in ein bestimmtes zelluläres Komparment transportiert wird, vom Rezeptor abdissozieren und/oder einen engen Kontakt mit einer Lipiddoppelschicht bestimmter Zusammenseztung und Fluidität etablieren muss. Die erste Möglichkeit wollen wir mittels Bildrekonstruktion cryo- mikroskopischer Aufnahmen von Partikeln überprüfen, die wir zu verschiedenen Zeiten nach der Infektion oder nach dem Ansäueren in vitro isolieren. Die zweite Möglichkeit werden wir untersuchen indem wir zu verschiednen Zeiten nach der Infektion feststellen wo das virale Kapsidprotein VP4, die N-terminalen Sequenzen von VP1, das poly-(A) Ende des viralen Genoms und Sequenzen in der Nähe des 5-Endes das Virion verlassen. Durch Einzelmolekül-Mikroskopie unterstützt werden wir versuchen die vermutete Membranpore zu charakterisieren und die eventuelle Beteiligung oligomerer Formen der viralen Proteine studieren. Die zu erwartenden Erkenntnisse sind unverzichtlich für ein volles Verständnis des Infektionsprozesses, der physikochemischen Vorgänge während des RNA Austritts und die Entwicklung neuer Virusinhibitoren.

Rhinoviren (RV) sind Auslöser von etwa 50% aller leichteren Verkühlungen und des landläufigen Schnupfens. Sie gehören zur grossen Familie der Picornaviren, die Tiere und Menschen infizieren. Unter ihnen sind die Erreger der Maul-und-Klauen Seuche, der Kinderlähmung und der Hepatitis A. Rhinoviren können auch Asthma verstärken und im Zusammenhang mit dieser und anderen Erkrankungen in seltenen Fällen lebensbedrohlich werden. Aufgrund der grossen Ähnlichkeit zwischen Rhinoviren und den oben-erwähnten anderen Vertretern der Picornavirusfamilie werden sie häufig als ein harmloseres Modell angesehen, können doch viele Ergebnisse mit RVs auf gefährlichere Picornaviren extrapoliert werden. Der erste Schritt einer Infektion ist das Andocken an ein geeignetes Protein an der Oberfläche der Wirtszelle. Das Virus wird daraufhin in die Zelle aufgenommen und auf verschiedenen Wegen in unterschiedliche Kompartimente transportiert. Der entscheidende Schritt ist die Freisetzung des RNA Genom ins Zytoplasma. Basierend auf dieser Vorlage produziert die zelleigene Maschinerie neue Viren, die unter Zerstörung der Wirtszelle nach aussen gelangen und sich so verbreiten. Für die über 170 verschiedenen RVs gibt es drei sehr unterschiedlich aufgebaute Rezeptoren, einen davon haben wir vor vielen Jahren identifiziert. Im Rahmen des gegenwärtigen Projektes konnten wir zeigen, daß RVs, die denselben Rezeptor benutzen, trotzdem unterschiedliche Internalisierungswege beschreiten. Das heisst dass nicht der Rezeptor allein dafür verantwortlich ist, sonderen wahrscheinlich Unterschiede in Stabilität und Ladung des Viruskapsids ebenfalls beteiligt sind. Im Rahmen verschiedener internationaler Zusammenarbeiten entwickelten wir Methoden zur Herstellung hochreiner Viren und zu einer neuartigen Analytik. Wir waren an der Identifikation einer zellulären Phospholipase beteiligt, ein Protein der Zelle, das für die Infektion essentiell ist; in deren Abwesenheit ist die Infektion stark vermindert. Ähnlich fanden wir, daß die Blockierung eines anderen Wirtszellproteins, einer Myristolytransferase, zu einer Inhibition des Virus führt. Das sind schöne Beispiele dafür, dass Interventionen auf Ebene der Zelle ausserordentlich gut geeignet sind Viren an der Infektion zu hindern, ohne Gefahr zu laufen, dass sie durch Mutationen resistent werden können. Schliesslich konnten wir die Bindungsstelle einer neuartigen Substanz identifizieren, die die wenigen Pleconaril-resistenten RVs neutralisieren kann. Pleconaril ist eine seit vielen Jahre bekannte antiviral wirksame Substanz, die leider aufgrund von Nebenwirkungen nie zugelassen wurde. Interessanterweise überlappt die neue Bindungsstelle nur geringfügig mit jener, die von nahezu allen bekannten Kapsid-bindenden antiviralen Substanzen, inklusive Pleconaril, erkannt wird.