Sterolester-Hydrolasen der Hefe

Sterolester (SE) und Triacylglycerole (TG) sind die wichtigsten Depot-Lipide in den meisten eukaryotischen Zellen. Bildung sowie Abbau bzw. Mobilisierung dieser Moleküle tragen wesentlich zur Lipidhomöostase bei. Während die Speicherung von SE und TG in sog. Lipidpartikeln, die Synthese und der Abbau von TG, sowie die Synthese von SE relativ gut untersucht sind, gibt es derzeit wenig Information zur Hydrolyse/Mobilisierung von SE. Ziel des vorgeschlagenen Projekts ist das Studium der Biochemie, Molekularbiologie und Zellbiologie der SE-Hydrolasen im Modellsystem Hefe, Saccharomyces cerevisiae. In der Hefe wurden die Genprodukte von YEH1, YEH2 und TGL1 als die drei wichtigsten SE hydrolysierenden Enzyme (Sterolesterasen) identifiziert. Um diese Enzyme genauer zu untersuchen, sollen im vorgeschlagenen Projekt enzymatische Eigenschaften, subzelluläre Lokalisierung und Topologie, sowie regulatorische Aspekte studiert werden. Bei der Charakterisierung von Yeh1p, Yeh2p und Tgl1p wird besonderes Augenmerk auf zweite enzymatische Aktivitäten oder Nebenaktivitäten dieser Enzyme, z.B. als Acyltransferasen oder Phospholipasen, zu legen sein, wie sie unlängst für andere lipolytische Enzyme gezeigt wurden. Subzelluläre Lokalisierung von Yeh1p und Tgl1p in Lipidpartikeln, und von Yeh2p an der Zellperipherie sind bereits beschrieben, aber Details wie etwa die duale Lokalisierung in Lipidpartikeln und dem Endoplasmatischen Reticulum wurden niemals untersucht. In diesem Zusammenhang soll eine mögliche Verschiebung der Enzyme innerhalb der Zelle unter bestimmten Bedingungen studiert werden. Diese Resultate werden zu einer genaueren Analyse von Targeting-Domänen und Membranankern führen, aber auch das Studium aktiver Zentren, Substratbindungsstellen und regulatorischer Domänen einschließen. Studien zur Membrantopologie und orientierung der SE Hydrolasen in den verschiedenen subzellulären Kompartimenten werden zum Verständnis der Enzymologie und der zellulären Funktion(en) beitragen. Als weiteres wichtiges Ziel des Projekts sollen regulatorische Aspekte der SE-Hydrolasen auf individueller und Genom weiter Ebene erforscht werden. Vor allem sollen Effekte einer gestörten SE-Synthese auf die subzelluläre Lokalisierung und die Aktivität von Yeh1p, Yeh2p und Tgl1p untersucht werden. Vice versa ist geplant, die Auswirkung defekter SE-Hydrolyse auf die Expression und Aktivität SE synthetisierender Enzyme zu überprüfen. Des Weiteren wird eine mögliche Feedback Kontrolle der SE-Hydrolyse auf die Synthese der Fettsäuren und Sterole zu untersuchen sein. Zusammenfassend werden diese Studien wichtige und neue Verknüpfungen zwischen Genexpression, Proteinbildung, subzellulärer Lokalisierung und Funktion der SE-Hydrolasen der Hefe aufzeigen. Die zu erwartenden Resultate werden unser Gesamtbild der Lipidhomöostase erweitern und nicht nur für Hefe, sondern auch für andere Zelltypen relevant sein.

Die zwei wichtigsten Speicherlipide in der Hefe Saccharomyces cerevisiae sind die Neutrallipide Triglyceride und Sterolester. Beide werden im Endoplasmatischen Reticulum synthetisiert. Die Enzyme Dga1p und Lro1p sind für die Bildung von Triglyceriden zuständig. Are1p und Are2p dienen hauptsächlich der Synthese von den Sterolestern, tragen allerdings auch, wenngleich zu einem sehr geringen Anteil, zur Triglyceridsynthese bei. Sterolester und Triglyceride werden in organell-ähnlichen Strukturen, den Lipidpartikeln gespeichert und können während des Wachstums oder in Hungerphasen von hydrolysierenden Enzymen mobilisiert werden, um ausreichend Energie und Membrankomponenten zur Verfügung zu stellen. Die Triglyceride werden von Triglyceridlipasen gespalten, und die Sterolester von den drei Sterolesterhydrolasen Tgl1p, Yeh1p and Yeh2p. Während Tgl1p und Yeh1p an den Lipidpartikeln lokalisiert sind, ist Yeh2p eine Sterolesterhydrolase an der Zellperipherie. Das Hauptthema dieses Projekts war es die regulatorischen Aspekte des Sterolester-metabolismus zu studieren. Einerseits wollten wir wissen, wie die zwei Sterolestersynthasen auf ein Fehlen der Sterolester spaltenden Enzyme reagieren. Wir konnten zeigen, dass Are1p und Are2p im Bezug auf die drei Sterolesterhydrolasen feedback reguliert sind. Zwar gab es keine Veränderungen der Genexpression und des Proteingehalts der zwei Acyltransferasen bei Nichtvorhandensein ihrer Gegenspieler, sehr wohl aber waren die in vitro Aktivität von Are1p und Are2p und ihr Potential in vivo radioaktiv markierte Fettsäuren in Sterolester einzubauen signifikant eingeschränkt. Andererseits analysierten wir das Verhalten der drei Sterolesterhydrolasen in Gegenwart oder Abwesenheit von Neutrallipiden. Dazu verwendeten wir Stämme denen entweder Sterolester, Triglyceride oder sogar die Lipidpartikel per se fehlten. Nur wenn die Zellen keine Lipidpartikel mehr aufbauen konnten, wurden Tgl1p und Yeh1p am Endoplasmatischen Retikulum retiniert. Dort zeigten sich die Enzyme äußerst instabil und verloren ihre Fähigkeit, Sterolester zu spalten. Weiters konnten wir bestätigen, dass Yeh2p an der Plasmamembran lokalisiert und auch an der Plasmamembran bleibt, auch wenn die Zellen keine Lipidpartikel mehr besitzen, und ein phosphoryliertes Protein ist. Zusammenfassend tragen die Ergebnisse dieses Projekts zum Verständnis einiger regulatorischer Aspekte des Sterolestermetabolismus in der Hefe bei.