Antisense Oligonukleotid vermittelte Verbesserung der SMaRT Therapie

Spliceosome Mediated RNA Trans-Splicing (SMaRT) ist eine vielversprechende therapeutische Anwendung für die Behandlung von vererbbaren, monogenen Erkrankungen, die durch dominante negative Mutationen hervorgerufen werden. Als Beispiel ist hier die blasenbildende Hauterkrankung Epidermolysis bullosa simplex Typ Dowling Meara (EBS-DM) anzuführen, in der eine dominante Mutation auf einem Allel für die phänotypische Ausprägung ausreichend ist. Die SMaRT Anwendung nimmt die endogene Splicing Maschinerie zu Hilfe um 2 ausgewählte RNA Moleküle über RNA Trans- Splicing zu rekombinieren. Hierdurch wird ein neues, chimäres Genprodukt erzeugt. Da nur partielle kodierende Abschnitte über RNA Trans-Splicing ausgetauscht werden, muss nur ein Genanschnitt kloniert und in virale Partikel verpackt werden. Die Expression des Target Gens wird weiterhin endogen reguliert, da die Korrektur auf pre-mRNA Ebene erfolgt. Die Korrektur der mutierten Transkripte führt zur Reduktion mutierter Proteine, wodurch man den dominant negativen Effekten der Mutation entgegenwirkt. Wir haben kürzlich in vitro die Anwendbarkeit von SMaRT für die Korrektur einer heterozygoten dominanten Mutation in KRT14 gezeigt. Dabei konnte eine partielle Reversion des EBS-DM assoziierten Krankheitsbildes erreicht werden. Der Fokus dieses Antrags liegt auf der über RNA Trans-Splicing vermittelten Optimierung der KRT14 Reparatur durch die Zugabe von Antisense Oligonukleotiden (ASO). Die Anwendung von Antisense Oligonukleotiden für die Beeinflussung der Splice Site Verwendung wurde kürzlich erfolgreich als therapeutische Strategie für die Behandlung der Spinalen Muskelatrophie (SMA) herangezogen. Wir nehmen an, dass die Zugabe von Antisense Oligonukleotiden, die kompetitive Cis-Splicing Signale innerhalb der Target pre-mRNA blockieren, die Trans-Splicing Reaktion fördern und so die Trans-Splicing Effizienz signifikant erhöhen können. Schlussendlich soll eine vollständige Reversion des EBS-DM Phänotyps erreicht werden. Das Projekt involviert die Etablierung einer Screening Methode für die Selektion von Antisense Oligonukleotiden, die die Trans-Splicing Effizienz von konstruierten RNA Trans-Splicing Molekülen für die KRT14 Korrektur erhöhen können. Durch nur geringfügige Modifikationen an unserem Screening System ist dessen Einsatz für zahlreiche auf Antisense basierende Anwendungen anwendbar und kann somit unser aktuelles Verständnis gegenüber regulativen Mechanismen des RNA Splicings fördern. Die funktionelle Korrektur von KRT14 und die daraus resultierende korrekte Expression und Lokalisierung von Wildtyp-KRT14 soll über die Konstruktion von 3D Hautäquivalenten gezeigt werden. Zusätzlich soll eine Reduktion des für EBS-DM Keratinocyten typische migratorischen und invasiven Potentials ersichtlich sein. Ein erfolgreicher Ausgang des Projekts bringt uns unserem Ziel, der Entwicklung einer auf Stammzellen basierenden ex vivo Gentherapie, entscheidend näher. Dabei werden über RNA Trans-splicing korrigierte Stammzellen eines EB-Patienten zu Hautäquivalenten differenziert, die dann auf schwerwiegend betroffene Hautregionen des Patienten transplantiert werden.

Epidermolysis bullosa simplex (EBS) ist eine seltene, blasenbildende Hauterkrankung, die hauptsächlich durch bestimmte Mutationen im Keratin 14 Gen versursacht wird. Dieses Gen kodiert für ein Protein, das ein wichtiger Bestandteil des Zytoskeletts basaler Keratinozyten der Haut ist. KRT14 Genmutationen bewirken eine Instabilität im Zytoskelett, wodurch bereits geringe, mechanische Traumata zur Blasenbildung in der Haut führen. Um KRT14 Mutationen in Patientenzellen der generalisierten, schwerwiegenden EBS (EBS-gen sev) zu korrigieren, verwenden wir die SMaRT (Spliceosome-Mediated RNA Trans-splicing) Technologie. Hier wird das mutierte Gen mit einem Reparaturmolekül (RNA trans-splicing molecule, RTM) auf RNA Ebene rekombiniert, wodurch ein korrigiertes Genprodukt entsteht. Das RTM besteht aus der einzubringenden gesunden KRT14 Gensequenz, bestimmten Hilfssignalen und einer Bindesequenz für das KRT14 Gen. Bisher konnte die SMaRT Methode bereits erfolgreich für die Korrektur von diversen anderen, bei EB betroffenen Genen angewandt werden, wobei allerdings nur eine eher geringe Trans-Splicing Effizienz erreicht werden konnte. Um die Korrektureffizienz zu erhöhen, haben wir in diesem Projekt "antisense-RNAs" (asRNAs), sowie rational generierte antisense Oligonukleotide (ASO) hergestellt und diese zusammen mit einem KRT14-RTM in Zielzellen eingebracht. Durch die gemeinsame zelluläre Einbringung von RTM und asRNAs/ASOs, sollte eine Blockade von stabilisierenden Elementen innerhalb der mutierten KRT14 Zielregion erreicht werden, wodurch es zu einer höheren Effizienz beim Einbau des RTMs kommen soll. Insgesamt wurden 74 asRNAs und 9 ASOs mit einem auf Fluoreszenz-basierenden Screening System in einem Modelsystem getestet. Wir konnten eine signifikante Steigerung der Trans-Splicing Effizienz, also der Rekombination, detektieren, und über PCR Analysen bestätigen. Protein Analysen von Hautzellen, die mit dem effizientesten ASO und dem RTM behandelt wurden, zeigen eine beinahe vollständige Normalisierung der K14 Proteinlevels. Diese Resultate weisen darauf hin, dass eine kombinierte Behandlung mit SMaRT und ASOs die Stabilität der Haut, und folglich den EBS Phänotyp, weiter verbessern kann.