Freisetzung von Rhinovirus RNA: Struktur & Protein Interaktionen

Ziel des Projektes ist die Aufklärung der strukturellen Änderungen des RNA Genoms eines viralen Schnupfenerregers während der frühen Phase der Infektion im Kontext des viralen Kapsids. Diese umfassen die Umwandlung nativer Viren in expandierte A-Partikel in Endosomen, sowie die Passage der RNA vom Virusinneren in das Zytosol. Diese Untersuchungen sollen mittels UV-induzierter Quervernetzung, chemischer Modifikation,Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie, Massen- spektrometrie, massiven parallelen Sequenzierens und Cryo-Elektronenmikroskopie realisiert werden. Wir werden Änderungen in Art und Position von Kontakten zwischen Aminosäureresten der Proteinhülle und Nukleotiden des viralen Genoms im Verlauf der RNA Freisetzung identifizieren. Des Weiteren wollen wir die Faltung der viralen RNA in Lösung, innerhalb der nativen Virushülle und im Inneren von A-Partikeln vergleichen und daraus den Einfluss des Proteinkapsids auf die Konformation der RNA ableiten. Im Rahmen des Projektes wird außerdem erforscht welches Ende der viralen RNA in infizierten Zellen sowie in davon isolierten Virus-transportierenden Endosomen zuerst das Kapsid verlässt und mit schon bestehenden in vitro Daten verglichen werden. Der Transfer der viralen RNA aus dem Virion ins Zytoplasma (von sauren Endosomen) ist sehr rasch. In vitro ist dieser durch niedrigen pH ausgelöste Vorgang jedoch ineffizient. Wir werden daher auch danach trachten jene Faktoren zu identifizieren, die diesen Vorgang katalysieren. Die Resultate unserer Untersuchungen werden ein möglichst vollständiges Bild der Freisetzung des Genoms aus dem Kapsid liefern und einen tieferen Einblick in die Dynamik, die Rolle der Faltung und der Protein Kontakte der viralen RNA bei einer Infektion durch Enteroviren ermöglichen.

Picornaviren sind kleine infektiöse Partikel, deren Einzelstrang-Ribonukleinsäure (ssRNA) Genom kompakt in einem kugelförmigen, aus 60 Kopien der viralen Proteine VP1, VP2, VP3, und VP4 bestehenden Kapsid verpackt ist. Die zahlreichen Vertreter wie Rhino-, Polio-, Coxsackie- und Maul- und Klauenseuche Viren können milde Erkältungen aber auch schwere bis zu tödlich verlaufende Krankheiten in Mensch und Tier hervorrufen. Die Infektion beginnt mit dem Anheften jener Viren an ein Rezeptorprotein der Wirtszelle und deren anschließenden Transport ins Zellinnere zur Freisetzung ("uncoating") der ssRNA aus dem schützenden Kapsid ins Zytosol für die Produktion neuer Viren. Ein detailliertes Verständnis dieser Schritte ist Voraussetzung für die Entwicklung neuartiger antiviraler Substanzen. In diesem Projekt sollte daher die Struktur der rhinoviralen ssRNA, mit dem Kapsid interagierende Sequenzen, sowie potentielle Katalysatoren des "uncoating" ermittelt werden. Nach einer Reihe unergiebiger Versuche war es jedoch absehbar, dass diese Ziele im Förderzeitraum kaum erreichbar sein würden. Aufgrund einer bioinformatischen Analyse, welche in der rhinoviralen RNA mehrere G-Quadruplex (G4) Motive auffand, haben wir stattdessen die mögliche Rolle dieser atypischen Nukleinsäure-Sekundärstruktur untersucht. Durch zahlreiche biophysikalische Studien konnten wir deren Ausbildung eindeutig nachweisen und zeigen, dass eine Behandlung mit G4-bindenden Stoffen wie Pyridostatin (PDS) die Freisetzung der ssRNA aus dem Rhinovirus Kapsid stark beeinträchtigt. Wir fanden zudem, dass PDS in gewissen Puffern Fasern ausbildet, die Rhinovirus Partikel ähnlich den extrazellulären Netzen von Neutrophilen einfangen und so deren Anheftung an die Wirtszelle verhindern. In Zusammenarbeit mit anderen Forschern haben wir weiters eine monolithische Anionenaustauschchromatographie zur Produktion hochreiner Rhinoviren etabliert. Diese dienten anschließend zur Validierung von nanoDSF als potente Methode zum Auffinden neuartiger "uncoating" Inhibitoren im Hochdurchsatz. Schließlich haben wir auch die Rolle einer Fettsäure ermittelt, die ans Kapsidprotein VP4 der meisten Picornaviren angeheftet wird. Die Inhibierung der dafür verantwortlichen zellulären Enzyme durch DDD85646, einem ursprünglich gegen Trypanosomen entwickelten Wirkstoff, führte zur drastischen Reduktion der Infektiosität der meisten Mitglieder dieser Familie. In dieser Arbeit konnten wir dafür multiple Gründe identifizieren, rangierend vom ineffizienten Zusammenbau und Reifung neuer Viruspartikel bis zu einer verminderten RNA Freisetzung von den wenigen noch gebildeten Viren. In einer Nachfolgestudie mit einer amerikanischen Gruppe konnten wir überdies zeigen, dass auch die Vermehrung der für Lassa Fieber und andere Erkrankungen verantwortliche Arenaviren mit DDD85646 effizient unterdrückt wird. Zusammenfassend liefern unsere Ergebnisse wichtige Beträge für ein grundlegenderes Verständnis der Vermehrung von Picornaviren und dienen gleichzeitig als Grundlage zur Entwicklung neuartiger, breit wirksamer antiviraler Substanzen.