Friedreich Ataxie Model mit Neuronen von Patienten iPS Zellen

Die Friedreich Ataxie (FRDA) ist eine autosomal rezessive Erkrankung, der eine GAA Triplettexpansion in dem Gen, welches für das mitochondriale Protein Frataxin kodiert, zugrunde liegt. Periphere sensorische Neurone der Hinterwurzelganglien mit propriozeptiven Eigenschaften sind pathophysiologisch am stärksten betroffen. In verschiedenen Tiermodellen der FRDA wurde eine aufgrund der GAA Triplettexpansion vermittelte Reduktion des Frataxin Proteins, mitochondriale Veränderungen sowie Neurodegeneration in spezifischen Zellen als besondere Merkmale der humanen Erkrankung nachgewiesen werden. Jedoch konnten diese Studien zentrale Fragen bezügliche der FRDA Pathophysiologie nicht beantworten, zum Beispiel, warum spezifische neuronale Population besonders anfällig sind. Unklar ist weiters zu welchem Zeitpunkt in der Ontogenese die ersten Defekte in humanen betroffenen Neuronen entstehen? Wir beabsichtigen, diese Fragestellungen aufzugreifen und dazu FRDA patientenspezifische induzierte pluripotente Stamm- (IPS) Zellen, mit entsprechenden GAA Triplettexpansion und daraus resultierendem verminderten Frataxin Proteingehalt, mittels in-vitro und in- vivo Experimenten zu analysieren. Als Basis dient die bereits erfolgreiche Generierung von iPS Zellen von FRDA Patienten, in welchen wir sowohl die pathologische Triplettexpansion als auch eine Reduktion des Frataxingehaltes nachweisen konnten, und von gesunden Probanden. Es gelang uns auch die Zellen in eine neuronale Population mit peripher sensorischem Phänotyp zu differenzieren (Eigentler et al 2013). Um die selektive Anfälligkeit/Suszeptibilität bestimmter neuronaler Zellen gegenüber reduzierter Frataxinwerte zu untersuchen, planen wir klassische/spezifische FRDA Merkmale in verschiedenen neuronalen Zelltypen, welche vom gleichen Patienten stammen, zu analysieren. Wir werden dazu FRDA periphere sensorische Neurone mit telenzephalen Neuronen vergleichen. Das Differenzierungsprotokoll für telenzephale Neurone wurde in unserem Labor bereits für humane embryonale Stammzellen etabliert (Nat et al 2012). Um einen möglichen Defekt während der neuronalen Entwicklung aufzudecken, planen wir sensorische Neurone, welche einerseits von FRDA Patienten andererseits von Kontrollen stammen, während ihres in vitro Heranreifens bezüglich ihrer funktionellen Charakteristika zu vergleichen. Weiters werden wir untersuchen, ob die Reduktion des Frataxingehaltes die Entwicklung von peripheren sensorischen Neuronen und ihre Fähigkeit neuronale Kreisläufe auszubilden in vivo, beeinflusst. Dazu werden wir humane sensorische Vorläuferzellen, von FRDA und Kontrollpersonen, in Hühnerembryonen transplantieren und die weitere Differenzierung der Vorläuferzellen analysieren sowie andererseits deren funktionelle Integration in spinale monosynaptische Reflexbögen untersuchen.

Patienten-spezifische induzierte pluripotente Stammzellen (iPS Zellen) sind relevante und wichtige Modelle für Erkrankungen, da sie die Möglichkeit bieten spezielle menschliche, normalerweise nicht leicht verfügbare Zellen, wie Nervenzellen zu generieren. Verschiedene neuronale Zelltypen des peripheren und zentralen Nervensystems sind speziell betroffen bei genetischen mitochondrialen Erkrankungen, obwohl die zugrunde liegende Mutation in allen Zellen vorhanden ist. Dies trifft auch im Falle der Friedreich Ataxie (FRDA), einer autosomal rezessiven Erkrankung aufgrund einer Mutation in einem Gen, welches das mitochondriale Protein Frataxin codiert, zu. Um die Mechanismen der zugrunde liegenden mitochondrialen Dysfunktion und der Neuronale Suszeptibilität zu entschlüsseln, wurden periphere und zentrale Neurone, entsprechend embryonaler Entwicklungsstadien (Stammzelle, Progenitorzelle und post- mitotische Neurone), von FRDA Patienten und gesunden Kontrollen generiert. Die Charakterisierung phänotypischer Meilensteine für jedes Stadium ermöglichte eine homogene und effiziente Differenzierung und Vergleichbarkeit zwischen gesunden und Patienten-Zellen. Weiters untersuchten wir die mitochondriale Morphologie, Atmung, reaktive Sauerstoffspezies (ROS) Produktion, ATP Produktion und Apoptosis um mitochondriale Defekte in Patienten-Zellen zu detektieren. Mitochondriale Morphologie, ROS-Produktion und Apoptosis veränderten sich während der Differenzierung, jedoch ohne Unterschied zwischen gesunden und FRDA-Zellen. Jedoch konnte eine Veränderung von Glycolyse in Stammzellen hin zu oxidativer Phosphorylierung mit erhöhter ATP Produktion in Progenitorzellen und Neuronen detektiert werden. ATP Produktion und maximale Atmungskapazität waren geringer in FRDA Zellen verglichen mit Kontroll-Zellen, mit dem größten Unterschied in peripheren sensiblen Nervenzellen. Dieses Zell-basierte Modell erlaubte zudem die Dynamik und krankheitsrelevante Expression von Frataxin und weiteren mitochondrialen- sowie zellulären Stress- und Inflammations- markern, Eisen-, Kalzium- und Lipidstoffwechselwege eingeschlossen, zu untersuchen. Deren unterschiedliche Expression erklärte einiger der Neuronen-spezifischen Phänotypen in FRDA, ergab jedoch weitere neue Fragestellungen. Des Weiteren untersuchten wir wie Frataxin-Defizienz das Verhalten humaner peripher- sensibler Vorläuferzellen und Neurone nach Transplantation in Hühnerembryonen beeinflusst. Während sich die transplantierten humanen Neuronen in Hühner - Nervenganglien integrierten, sind weitere Untersuchungen nötig um deren Funktionalität zu evaluieren. Diese in vitro und in vivo Ergebnisse halfen die Ereignisse, welche die frühe humane Nervenzellentwicklung widerspiegeln, zu verstehen. Weitere Untersuchungen betreffend der mitochondrialen Pathophysiologie und des mitochondrialen Netzwerkes sind essentiell für die Identifizierung neuer und effektiver Therapiestrategien in FRDA und anderer mitochondrialer neurologischer Erkrankungen.