Inhibierung von Drg1

Die zytoplasmatische AAA-ATPase Drg1 besteht aus einer N-terminalen Domäne und zwei AAA-Domänen und bildet Hexamere in Lösung. Wir konnten bereits in früheren Arbeiten zeigen, dass Drg1 eine Schlüsselrolle in der Reifung der großen ribosomalen Untereinheit spielt. Das Protein bindet im Zytoplasma an prä-ribosomale Partikel kurz nach ihrem Export aus dem Zellkern und ist essentiell für die Ablösung von shuttling Proteinen und Export Faktoren. Kürzlich konnten wir zeigen, dass Drg1 durch direkte Interaktion mit dem prä-ribosomalen Reifungsfaktor Rlp24 an das prä-60S Partikel rekrutiert wird. Diese Interaktion führt zu einer starken Stimulierung der ATPase Aktivität von Drg1. Diese verstärkte Aktivität wird benötigt um Rlp24 vom prä-Ribosom abzulösen. Unsere unpublizierten Resultate zeigen, dass diese verstärkte ATPase Aktivität von Drg1 durch einen spezifischen niedermolekularen Inhibitor gehemmt werden kann. Da durch den Inhibitor nur die stimulierte ATPase Aktivität gehemmt wird, nicht jedoch die basale Aktivität von Drg1, scheint der Wirkstoff einen neuen Wirkungsmechanismus aufzuweisen. Ziel dieses Projektes ist es den genauen Wirkungsmechanismus des Inhibitors aufzuklären. Dazu werden wir Biochemische und Strukturbiologische Methoden anwenden. Die detaillierte Beschreibung des Wirkmechanismus des Inhibitors wird wichtige Impulse für die Entwicklung von spezifischen, hoch affinen Inhibitoren gegen die aktivierte Form auch von anderen AAA-ATPasen liefern. Solche Inhibitoren könnten zur Entwicklung neuer Hemmstoffe für die klinische Behandlung von humanen Erkrankungen und Krebs führen. Zusätzlich ist die Ribosomenbiogenese ein vielversprechendes Ziel für die zukünftige Entwicklung von Wirkstoffen zur antimikrobiellen und anti-Tumor Chemotherapie. Wegen seiner Schlüsselfunktion in der Ribosomenbiogenese ist Drg1 ein perfektes Ziel für die Entwicklung von niedermolekularen Hemmstoffen dieses essentiellen Stoffwechselweges. Mit der detaillierten Untersuchung der Auswirkungen einer Blockierung der Ribosomenbiogenese auf vorgeschaltete bzw. nachfolgende Reifungsschritte, wird dieses Projekt auch einen wichtigen Beitrag zur Evaluierung des Potenzials von Inhibitoren der Ribosomenbiogenese leisten.

Das Protein Drg1 aus der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae gehört zur Proteinfamilie der AAA-ATPasen. Mitglieder dieser Familie sind als Chaperone aktiv indem sie die durch ATP Hydrolyse zur Verfügung gestellte Energie nutzen um Proteine zu entfalten oder makromolekulare Komplexe umzuformen. In früheren Arbeiten konnten wir zeigen, das Drg1 zwei ATPase Domänen besitzt (D1 und D2) und Hexamere ausbildet. Im Zuge der Ribosomenbiogenese bindet Drg1 an prä-ribosomale 60S Partikel, direkt nachdem diese aus dem Kern ins Zytoplasma transportiert wurden. Dort katalysiert Drg1 unter ATP Hydrolyse die Freisetzung des Reifungsfaktors Rlp24 von diesen prä-ribosomalen Partikeln. Dies ermöglicht deren weitere Reifung und gleichzeitig den Rücktransport des freigesetzten Rlp24 in den Kern wo es in neue Prä-Ribosomen eingebaut wird. Da die Ablöse von Rlp24 eine zwingende Voraussetzung für alle weiteren Reifungsschritte der prä-ribosomalen Partikel darstellt, ist eine Blockade von Drg1 für die Zelle letal. Dies konnten wir kürzlich durch Verwendung des Wirkstoffes Diazaborin zeigen, der spezifisch die Aktivität von Drg1 und damit die Ablösung von Rlp24 hemmt. Damit stellt Diazaborin den ersten bekannten Inhibitor der eukaryotischen Ribosomenbiogenese dar. Da diese ein für alle Zellen überlebenswichtiger Prozess ist und z.B. in Krebszellen übermäßig aktiv ist, bietet sie ein vielversprechendes Ziel für die Entwicklung von spezifischen Inhibitoren zur Behandlung von Tumoren und Infektionskrankheiten.Das Ziel dieses Projekts war es daher den molekularen Wirkmechanismus von Diazaborin und seine Auswirkung auf die Ribosomenbiogenese besser zu verstehen. Mit isoliertem Drg1 Protein konnten wir die Bindung von Diazaborin an sein Ziel charakterisieren und zeigen, dass es spezifisch in die für die Ablöse essentielle D2 ATPase Domäne von Drg1 bindet und diese blockiert. Dies konnten wir in einem in vitro Modell mit isolierten Proteinen nachweisen. Darüber hinaus haben wir die weitreichenden Folgen der Inhibierung von Drg1 durch Diazaborin auf die Reifung der ribosomalen Partikel untersucht. Da die Wirkung von Diazaborin nahezu unmittelbar einsetzt und zu einem gestörten Rücktransport von Reifungsfaktoren führt, konnten wir diesen extrem dynamischen Prozess mit bisher ungekannter zeitlicher Auflösung verfolgen und daraus neue Erkenntnisse über den genauen Ablauf ableiten. Diese neuen Einblicke wurden in hochrangigen Journalen veröffentlicht und stießen auf internationalen Fachkonferenzen auf großes Interesse.