Die Jagd nach neuen antifungalen Strategien: das antifungale Protein PAF

Das niedermolekulare, kationische, Cystein-reiche und antifungale Protein PAF aus Penicillium chrysogenum ist toxisch für zahlreiche pflanzen- und opportunistische zoo- und humanpathogene filamentöse Ascomyceten (Schimmelpilze). Nuklear Magnet Resonanz (NMR) Spektroskopie Experimente und die Anwendung mutierter PAF Varianten zeigten, dass bestimmte Motive auf der Proteinoberfläche an der Regulation der Interaktion mit Pilzen beteiligt sind. Unsere bisherigen Daten lassen darauf schließen, dass die pilzliche Plasmamembran eine zentrale Rolle spielt in der Bindung und Aufnahme von PAF in die Pilzzellen und im Auslösen von zellulären Signaltransduktionswegen. Unsere Resultate zeigen außerdem, dass PAF mit spezifischen Lipidkomponenten der Plasmamembran interagiert und - in Kombination verwendet - die Effizienz von herkömmlichen Membran- interagierenden Antimykotika, z. B. Azolen, signifikant verbessern kann. Die antifungale Aktivität sowie der Umstand, dass PAF in vitro keine negativen Effekte auf primäre Säugetierzellen aufweist, machen PAF zu einem vielversprechenden Kandidaten zur Entwicklung neuer und effizienter antifungaler Strategien, die in der Medizin, in der Landwirtschaft und in der Nahrungsmittelindustrie zur Behandlung und Bekämpfung von Pilzinfektionen erfolgreich eingesetzt werden können. Ein detailliertes Wissen über den Wirkungsmechanismus von PAF ist daher besonders wichtig. Wir wollen in unserem Projekt folgende Aspekte untersuchen: Variation der PAF Toxizität durch Stellen-spezifische Mutagenese: Herstellung und Produktion mutierter PAF Varianten in einer P. chrysogenum paf-Deletionsmutante für Struktur/Funktionsanalysen Charakterisierung der Interaktion von PAF mit sensitiven Pilzen: pharmakologischer Ansatz zur Modulierung der Lipidbestandteile der pilzlichen Membran und Untersuchung der Effekte auf die PAF-Sensitivität von Schimmelpilzen; Austesten der PAF-Sensitivität von Mutanten mit Defekten im Lipidmetabolismus; Protein-Lipid Interaktionsassay zur Untersuchung der Rolle bestimmter Proteinmotive auf der Oberfläche von PAF in der Lipidbindung; NMR Spektroskopie zur Analyse der Interaktion von PAF und mutierten PAF Varianten mit der Pilzmembran; Mikroskopische Fluoreszenzstudien zur Bindung und Aufnahme von PAF und mutierten PAF Varianten in Schimmelpilzen Das antimykotische Potential von PAF als Bestandteil einer Kombinationstherapie in vitro und in einem Insekten- Tiermodell (in vivo). Zusätzlich zu einem detailliertem Wissen über das antifungale Potential von PAF, trägt unser Projekt zu einem besseren Einblick in spezifische zelluläre Prozesse von Schimmelpilzen bei, die weniger gut verstanden werden als in anderen, besser charakterisierten pilzlichen Modellorganismen wie z.B. Hefen. Darüberhinaus ist zu erwähnen, dass unser Projekt zur deutlichen Verbesserung und Verfeinerung von Techniken in der NMR Sprektroskopie beitragen wird.

Das Auftreten von Pilzinfektionen und die rasche Entwicklung von Resistenzen gegen vorhandene Therapien ist in den letzten Jahrzehnten dramatisch angestiegen. Neue, kostengünstige antimykotische Therapiemöglichkeiten ohne schwere Nebenwirkungen für den infizierten Wirt sind daher dringend erforderlich. Das Penicillium chrysogenum AntiFungale Protein PAF wird vom Penicillin-produzierenden Schimmelpilz P. chrysogenum gebildet und hat großes Potenzial für die Entwicklung neuer antimykotischer Therapien, da es das Wachstum von human-, tier- und pflanzen- pathogenen Pilzen hemmt. Das primäre Ziel dieses Projektes war es, Struktur und Funktion genauer kennen zu lernen, um PAF in Zukunft richtig nutzen zu können bzw. seine antifungale Effizienz durch rationales Proteindesign sogar noch zu verbessern. Mithilfe der Herstellung und genauen Analyse von PAF Varianten, in denen bestimmte Aminosäuren (AS) ausgetauscht wurden, konnten wichtige Einblicke gewonnen werden, wie sich diese Veränderungen auf Struktur und Funktion auswirken. Um eine große Menge von korrekt gefalteten Proteinvarianten in bester Qualität für diese Analysen zu produzieren, wurde ein Proteinexpressionssystem entwickelt, das den PAF Produzenten selbst, P. chrysogenum, als Proteinfabrik verwendet und eine einfache, kostengünstige Reinigung der rekombinant hergestellten PAF Varianten aus dem Kulturüberstand ermöglicht. Analysen der Proteinstruktur mittels Kernspinresonanz (NMR) Spektroskopie ergaben, dass die AS Austäusche die 3D Proteinstruktur wenig veränderten, aber einen signifikanten Einfluss auf die Oberflächeneigenschaften (z.B. die Oberflächenladung) der Proteinvarianten hatte, was sich z.T. auf Proteinbereiche auswirkte, die weit von der Mutationsstelle entfernt liegen. Diese Veränderungen beeinträchtigen die Bindung der PAF Varianten an die Pilzzellen, verhindert deren Aufnahme und Interaktion mit intrazellulären Signalwegen, die für die Proteinfunktion wichtig sind, und führten zu einem Verlust der antifungalen Aktivität. Weiters konnten wir beobachten, dass die Struktur von PAF nicht statisch ist, sondern ein geringer Prozentsatz von PAF strukturell variiert, was ebenfalls dessen Funktion beeinflussen könnte. Der Tatsache, dass Kalziumionen aus dem umgebenden Medium die antifungale Wirkung von PAF neutralisieren kann, wurde nachgegangen, und unsere Analysen ergaben, dass PAF Kalziumionen binden kann, aber diese Interaktion keinen Einfluss auf die Proteinfunktion hat. Die Bedeutung dieser Bindung wird weiter untersucht. Auf der Suche nach möglichen PAF-Interaktionspartnern untersuchten wir im Speziellen die Lipidzusammensetzung der Zellmembranen des PAF- sensitiven Modellpilzes Neurospora crassa und deren Rolle in der PAF-Sensitivität. Dies gewährte uns neue Einblicke in mögliche Zielmoleküle für die Entwicklung neuer antifungaler Wirkstoffe. Schließlich wurde die Struktur und Funktion von PAF-verwandten antifungalen Proteinen aus den Zitrusfrüchte-infizierenden Schimmelpilzen Penicillium digitatum und Penicillium expansum charakterisiert. Es wurden Strukturmotive identifiziert, die die antifungale Aktivität bestimmen, und die Speziesspezifität dieser antifungalen Proteine nachgewiesen, die in der Haltbarmachung von Lebensmitteln und im Pflanzenschutz einsetzbar sein könnten. Die Ergebnisse dieses Projekts tragen wesentlich zu Verständnis von Struktur und Funktion von PAF und verwandten Proteinen bei - eine wichtige Voraussetzung zur Entwicklung neuartiger Medikamente mit neuem Wirkungsmechanismus. Aus diesem Grund ist unsere Forschung für eine zukünftige Anwendung von antifungalen Proteinen aus Schimmelpilzen in der Landwirtschaft und in der Medizin von extrem wichtiger sozial-ökonomischer Bedeutung.