NMR der paramagnetischen Relaxationserhöhung in Lösung

Die NMR Spektroskopie entwickelte sich in eine der grundlegenden Methoden in der Strukturbiologie und ermöglicht nicht nur die Bestimmung der dreidimensionalen Struktur sondern auch von dynamischen Aspekten biologischer Makromoleküle. Relaxationserhöhungen in einer paramagnetischen Umgebung (Lösungsmittel PREs) erwiesen sich als hilfreich zur Bestimmung der Orientierung und Eindringtiefe von Peptiden in Membranmimetika und auch zur Strukturbestimmung von Proteinen. Im Zuge des vorgelegten Projektes werden wir die Anwendungsbreite von Relaxationserhöhungen durch paramagnetische Lösungsmittelzusätze erweitern auf biophysikalische Fragen über eine kürzlich von uns entdeckte katalytische Kationen-? Wechselwirkung in einer Transmembranhelix der Hefe V-ATPase, Dynamik von Proteinen sowie Protein-Ligand Wechselwirkungen. Wir werden die Bedingungen um Arginin in einer hydrophoben Umgebung eines Membranmimetikums zu halten ermitteln und die pKs Werte von geladenen Aminosäuren in einer hydrophoben Umgebung mittels NMR Spektroskopie untersuchen. Die Beantwortung dieser Fragen wird es erlauben die molekularen Details der Funktion von katalytisch aktiven Argininresten in einer Reihe von Membranproteinen zu entschlüsseln. Relaxationserhöhungen in paramagnetischer Umgebung werden auch benutzt werden um Informationen über das dynamische Verhalten von Proteinen durch Vergleich von experimentellen mit theoretischen PREs zu erhalten. Konformationen welche in NOE-basierten oder Kristallstrukturen verborgen sind beeinflussen PREs, welche Informationen über die Lösungsmittelzugänglichkeit beinhalten. Diese Methode wird auch an teilweise oder komplett unstrukturierten Proteinen angewendet werden um Bereiche mit transienter Struktur zu identifizieren. Weiters werden wir "übertragene PREs" benutzen um Informationen über die Eindringtiefe und Orientierung von Liganden gebunden an große Proteinrezeptoren zu ermitteln. Für diese übertragenen PREs ist keine chemische Modifikation oder Isotopenmarkierung notwendig und sie können an Rezeptoren ohne Größenlimit angewendet werden. Die erhaltene Information kann als experimenteller Input für Ligandendockingrechnungen genutzt werden oder um die Bereiche eines Wirkstoffkandidaten zu identifizieren wo eine chemische Modifikation das höchste Potential hat die Bindungsstärke zu verändern.

Die NMR Spektroskopie stellt eine der wichtigsten Analysenmethoden zur Bestimmung der Strukturen von organischen und Biomolekülen dar. Für die Bestimmung der dreidimensionalen Molekülstrukturen werden dabei hauptsächlich Atomdistanzen, welche aus NMR Spektren abgeleitet werden benutzt. Im Zuge dieses Projektes entwickelten wir neue Ansätze um strukturrelevante Informationen mittels inerter paramagnetischer Bestandteile im Lösungsmittel (Kosolventien) zu erhalten. Paramagnetische Substanzen ändern die Linienbreite in NMR Spektren und zwar abhängig von der Entfernung zum paramagnetischen Zentrum. Wenn nun das gesamte Lösungsmittel paramagnetisch gemacht wird, kann man durch Messung der Linienbereite den Abstand zum Lösungsmittel, also praktisch der Moleküloberfläche, erhalten. Diese Information wurde zum Beispiel benutzt um den Mechanismus des Enzyms V-ATPase zu erhalten, welches eine wichtige Rolle bei der Regulation des pH-Werts, also die Konzentration von Wasserstoffionen, in Zellen spielt. Eine Fehlfunktion dieses Enzyms ist z.B. für die Entstehung der Osteoporose verantwortlich. Durch paramagnetische Linienverbreiterungen konnten wir zeigen dass eine spezielle Wechselwirkung zweier Aminosäuren für den Transport von Wasserstoffionen verantwortlich ist. Eine weitere Anwendung des Einflusses paramagnetischer Kosolventien war die Untersuchung der Wechselwirkung von Makrolidantibiotika mit Gallensäuren. Zusammen mit einer Gruppe der Universität Zagreb konnten wir zeigen, dass die Bindung dieser Antibiotika an Gallensäuren nicht die Aktivität unterdrückt, und unterschiedliche Antibiotika denselben Bindungsmechanismus an Gallensäureaggregate aufweisen. Desweiteren kann man die paramagnetischen Einflüsse auch benutzen um die Strukturen von Proteinen genauer zu bestimmen. Dies sollte die Auflösung von NMR Proteinstrukturen verbessen um sie zum Beispiel für strukturbasierte Wirkstoffforschung besser verwertbar zu machen.