Visualisierung des arbeitenden Translokase Motors SecA

Eine Vielzahl von Proteinen wird post-translational vom evolutionär konservierten hetero-trimeren Proteinkomplex SecY durch die bakterielle Plasmamembran transportiert. Durch Öffnung eines seitlichen Tores ermöglicht der als Translokon bezeichnete Kanal auch die Membraninsertion hydrophober Proteine. Im ersten Schritt der post- translationalen Translokation ist die Bindung des durch ATP-Hydrolyse angetriebenen Motorproteins SecA erforderlich, um im Folgenden die Polypeptidkette durch den passiven SecY Komplex zu transportieren. Der genaue Mechanismus der Translokation, sowie die tatsächliche oligomere Zusammensetzung und relative Orientierung aller beteiligten Komponenten wird seit geraumer Zeit kontrovers diskutiert. Verantwortlich dafür ist die Untersuchung des Translokons mit Techniken, die (i) entweder örtlich hochaufgelöste, jedoch statische Schnappschüsse der beteiligten Proteine geben (zB. Röntgenkristallographie, Elektronenmikroskopie), oder (ii) beschränkte dynamische Informationen über paarweise miteinander verknüpfbare Aminosäuren bzw. auf in Reichweite für einen Resonanzenergietransfer befindliche Aminosäurepaare liefern. Zudem waren die experimentellen Bedingungen methodenbedingt meist nicht darauf ausgerichtet, die nativen Bedingungen im Bakterium zu rekonstituieren. Der von uns gewählte Ansatz unterscheidet sich hierin grundlegend von den Vorrangegangenen, da wir die Transportmaschinerie unter anderem auf der Ebene von Einzelmolekülen und vor allem unter nativen Bedingungen, bei physiologischen Temperaturen und Pufferzusammensetzungen, mit einer Kombination aus Hochgeschwindigkeits-Rasterkraftmikroskopie (HS-AFM), Lumineszenz Resonanz Energietransfer (LRET) und Fluoreszenz Auto- und Cross-correlation Spektroskopie (FCS) untersuchen werden. Das HS-AFM ist ein bildgebendes Verfahren (bis zu ~40 Bilder pro Sekunde), das einzelne Proteine mit sub- molekularer Ortsauflösung abbildet. Es ist damit möglich, Konformationsänderungen in Echtzeit sichtbar zu machen. LRET ermöglicht die Messung von Distanzen zwischen zwei genetisch modifizierten Positionen innerhalb eines Proteins oder Proteinkomplexes mit einer Auflösung im Å-Bereich. FCS erlaubt präzise Mobilitäts- und Konzentrationsmessungen und in Verbindung mit einer Helligkeitsanalyse der unterschiedlichen diffundierende Spezies, die Quantifizierung der Bindung von SecA Monomeren oder Dimeren an den SecY Kanal. Mittels dieser Techniken werden wir I) Liganden- und ATP-induzierte Konformationsänderungen des isolierten Motorproteins SecA, II) den oligomeren Zustand des an den SecY Komplex gebundenen SecAs und die relative Orientierung der Bindungspartner, sowie III) Konformationsänderungen während der Translokation einer Polypeptidkette durch den Kanal direkt abbilden. Verfügbare Kristallstrukturen werden anschließend und unter Zuhilfenahme der LRET Ergebnisse in die so erzeugten molekularen "Filme" eingepasst um ein umfassendes Bild der mikroskopischen Abläufe und strukturellen Dynamiken während des Translokationsprozesses zu zeichnen und somit die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen besser zu verstehen.

Membranen schützen Zellen vor dem unerwünschten Verlust von genetischem Material, Proteinen und Nährstoffen. Damit entsteht im Inneren der Zelle ein individuelles Mikroklima, dass diese zur Erfüllung spezifischer Aufgaben in den verschiedenen Geweben und Organen befähigt. Die dafür erwünschte Abgrenzung des Zellinneren bedingt aber auch, dass spezielle Kanäle und Transporter in die Membran eingebaut werden müssen, damit die Zelle mit Nährstoffen versorgt werden kann. Der Einbau dieser Kanäle und Transporter obliegt dem sogenannten Translokon. Dieses hat auch die Aufgabe, Eiweiße, die in der Zelle produziert werden, aber an anderer Stelle benötigt werden, vom Zellinneren nach außen zu transportieren. Wie das Translokon funktioniert, ist nicht geklärt, da bildgebende Verfahren bisher auf tiefgefrorene Proben zurückgreifen mussten. Das Einfrieren geschieht in der Hoffnung, dass mehrere 1000 Translokons im gleichen Zustand verharren, da sonst das Signal-Rausch-Verhältnis zu schlecht ist. Anstelle tiefgefrorener und über mehrere 1000 Moleküle gemittelte Schnappschüsse, haben wir jetzt Bilder von einem einzelnen funktionsfähigen Translokon bei Raumtemperatur erstellen können. Der Fortschritt hat uns die Entwicklung eines neuartigen Chips abverlangt, in dem das Translokon in seiner natürlichen Umgebung, d. h. eingebettet in der Membran über einer absolut flachen Unterlage schwebt. Als Pfeiler, die die Trägermembran in einem definierten Abstand von der Unterlage halten, dienen die Gipfel anderer regelmäßig angeordneter Eiweiße. Die Abbildung selbst erfolgte mittels eines Atomkraftmikroskops, dass das Translokon mit einer kleinen Nadel, ähnlich der eines Plattenspielers, derart schnell abtasten kann, dass sogar der Zusammenbau des Translokons aus seinen zwei Hauptbestandteilen in der Membran gefilmt werden konnte: Zu sehen ist zunächst nur der Membrankanal, der dem Proteintransport durch die Membran dient. In einem zweiten Schritt nähert sich der eigentliche Translokations-Motor dem Kanal, springt auf den Kanal, als wollte er ein Eiweiß hindurch schieben, verlässt nach einer knappen Sekunde seinen Bindungsplatz auf dem Kanal wieder, um dann nach etlichen Wiederholungen des Auf und Ab letztendlich in seiner korrekten Position in Erwartung des zu transportierenden Substrats zu verharren. Der Chip ist auch für viele andere Membranproteine verwendbar und stellt somit ein universelles Werkzeug dar, das der Forschung von Transport und Signalisierungsprozessen bisher ungeahnte Möglichkeiten eröffnet.