Chip Elektrophorese von viralem RNA Transfer durch Membranen

Ziel des Projekts ist die Entwicklung eines in vitro Modellsystems für virale Zellinfektion basierend auf Chip Elektrophorese von in Liposomen verkapselten Molecular Beacons (MBs). MBs sind Sonden, welche sowohl durch einen Fluorophor als auch einen Quencher modifiziert sind. In Abwesenheit eines entsprechenden RNA Zielmoleküls verhindert die räumliche Nähe der Modifikationen Fluoreszenz. Nach Bindung des MB an komplementäre RNA geht die räumliche Nähe zwischen Fluorophor und Quencher verloren, Fluoreszenz wird detektiert. Im Zuge des vorgeschlagenen Projekts wird nun virale Zellinfektion (in Form von Transfer der viralen RNA durch die Lipidmembran des Liposoms) durch die Fluoreszenzzunahme des Vesikelpeaks beschrieben. Die Methodenentwicklung wird mit humanem Rhinovirus Serotyp 2 (HRV2), einem Mitglied der Picornavirusfamilie, erfolgen. HRVs sind für die Mehrzahl von Erkältungserkrankungen verantwortlich. Besonders HRV2 wurde bereits gut charakterisiert, dennoch konnten nicht alle Fragestellungen bezüglich des viralen RNA Transfers durch Lipidmembranen während viraler Infektionsschritte geklärt werden. Ein modulares Design des entwickelten Modellsystems soll eine zukünftige Anwendung bei einer Vielzahl weiterer Viren ermöglichen. Chip Elektrophorese soll auf einem komerziellen Instrument, ausgestattet mit einem roten Laser und einer blauen LED (Anregung / Emission bei jeweils 470 / 525 bzw. 635 / 685 nm) durchgeführt werden. Dieses System wurde in der Vergangenheit erfolgreich für die Analyse von Virus / Liposomkomplexen eingesetzt (vgl. z.B.: Weiss, V. U. et al, Electrophoresis 2009). Nichtsdestotrotz wurde ein erstes Modellsystems für virale Zellinfektion basierend auf einer reversen Transkriptase (RT) PCR (Bilek, G. et al, Journal of Virology 2011) erstellt. Die Verwendung von MBs anstelle einer RT PCR ergab bereits erste, vielversprechende Ergebnisse. Dabei ergeben sich aus der Verwendung von MBs Vorteile bezüglich einer RT PCR, wie (i) schnelle Analysenzeiten, (ii) gleichzeitige Detektion von RNA im Vesikellumen aber auch der Liposomenumgebung, sowie (iii) die Möglichkeit, ebenfalls Größenstandards innerhalb der Liposomen zu verkapseln, um die Vesikelintegrität während des viralen RNA Transfer zu überwachen. Die Empfindlichkeit des entwickelten Assays beruht auf dem ursprünglichen MB Design wie auch auf der Wahl der Reaktionsbedingungen (Puffer, Ionenstärke, etc.). Daher wurde für diese grundlegenden Schritte ein ausreichender Projektzeitraum reserviert. Zusätzlich soll die Entwicklung des in vitro Modellsystems noch durch orthogonale Analysenmethoden, einen nano Elektrospray Gas Phasen Electrophoretischen Molekülmobilitätsanalyzer (nES GEMMA) sowie ein nano Electrospray Ionisations Ionenmobilitäts Massenspektrometer (nESI IM MS), unterstützt werden, um die Funktionalität des MB zu demonstrieren.

Ziel des Projekts Chip Elektrophorese von viralem RNA Transfer durch Membranen war die Entwicklung eines Modellsystems für virale Zellinfektion. Dieses sollte auf miniaturisierter Elektrophorese basieren und die Trennung von Analyten in Lösung in einem elektrischen Feld ermöglichen. Liposome wurden als Zellmembrananaloga herangezogen. Der Transfer des viralen Erbmaterials (humanes Rhinovirus Serotyp 2, HRV2) in das Innere dieser Vesikel sollte mithilfe von Fluoreszenzsonden (Molecular Beacons, MBs) sichtbar gemacht werden. Der erste Teil des Projekts beschäftigte sich mit dem Nachweis von genetischem Material über MBs in Abwesenheit von Liposomen. Antioxidanszugabe zur Elektrolytlösung führte zu deutlich gesteigerter Fluoreszenz. Die Verwendung von Standards, welche bei einer anderen Wellenlänge als Analyten detektierbar waren, sorgte für vergleichbare Ergebnisse. Die resultierende Methode erlaubte uns daher, die Freisetzung viraler RNA zu verfolgen. Der nächste Schritt des Projektes befasste sich mit der Herstellung von Liposomen. Die Charakterisierung dieser Vesikel hinsichtlich Größe, Homogenität und Auftreten von Nebenprodukten erfolgte schließlich über Elektrophorese in der Flüssig- und Gasphase. Desweiteren wurden MBs in Liposomen verkapselt und ihre Reaktivität über miniaturisierte Elektrophorese getestet. Darüberhinaus wurden Polysaccharide als Größenstandards charakterisiert, um über diese Standards letztendlich die Vesikelintegrität zu beurteilen. Im Anschluß wurde nun der Transfer des viralen Genoms selbst untersucht. Zusätzlich zu Experimenten mit miniaturisierter Chipelektrophorese wurde versucht, den Transfer der viralen RNA mittels Spektroskopie einzelner Liposomenvesikeln zu verfolgen. Über eine Machbarkeitsstudie hinausgehende Ergebnisse konnten jedoch auf diese alternative Weise nicht gewonnen werden. Daher konzentrierte sich das Projekt in weiterer Folge auf die Aufreinigung von HRV2. Zwei verschiedene Ansätze lieferten schließlich jeweils hochreine Partikel, die sogar zur Bestimmung des Molekulargewichts großer intakter Proteinaggregate über Massenspektrometrie herangezogen werden konnten. Die gegebene natürliche Virusheterogenität beeinträchtigte jedoch die Experimente zum viralen Genomtransfer. Daher erscheint aus heutiger Sicht eine Nachfolgestudie zur Herstellung, Aufreinigung und ausführlichen Charakterisierung von HRV2 sinnvoll, um die natürlich auftretende Partikelheterogenität weiter zu reduzieren. Obwohl das angestrebte Modell der viralen Zellinfektion letztlich nicht komplett umgesetzt werden konnte, ist davon auszugehen, dass die Ergebnisse des Projekts die Charakterisierung von (Bio-) Nanopartikeln, insbesondere von Liposomen und Polyscchariden nachhaltig beeinflussen werden. Darüberhinaus wurde die Aufreinigung von HRV2 sowie das verwendete Chipelektrophoresesetup deutlich verbessert.