Biochemie der Peroxidasine

Enzyme der Peroxidase-Cyclooxygenase Superfamilie katalysieren biochemische Reaktionen, die in unzähligen biologischen Prozessen eine wichtige Rolle spielen, z.B. bei der unspezifischen Immunabwehr, der Synthese der Schilddrüsenhormone oder der Bildung und Modifizierung der extrazellulären Matrix. Sie sind zudem auch bei der Pathogenese von chronischen entzündlichen Erkrankungen beteiligt. In der Subfamilie 2 dieser Superfamilie findet man Multidomänen-Oxidoreduktasen, sog. Peroxidasine (Pxds). Hierbei handelt es sich um glykosylierte und sekretierte Häm-Peroxidasen, die zusätzlich zur katalytischen Domäne sog. Leucin-reiche Wiederholungssequenzen, Immunoglobulin C-ähnliche Domänen sowie von Willebrandfaktor C enthalten. Diese Strukturmotive finden sich in vielen extrazellulären Molekülen, die mit anderen Proteinen in Wechselwirkung treten. Ursprünglich wurde Peroxidasin in Basalmembranen von Drosophila entdeckt. Spätere Arbeiten zeigten, dass diese Enzyme auch in Wirbeltieren vorkommen und eine Rolle bei der unspezifischen Immunabwehr, der Gewebsbildung, Ausbreitung von Tumoren und oxidativen Prozessen eine Rolle spielen. Kürzlich wurde gezeigt, dass dieses Metallprotein mit Hilfe von Hypohalogeniten im Kollegen IV für die Bildung von kovalenten Kohlenstoff-Stickstoffbindungen verantwortlich ist, ein Prozess, der sowohl bei der Gewebsbildung als auch bei zahlreichen Kranksheitsbildern eine wichtige Rolle spielt. Trotz der physiologischen Bedeutung dieser neuen Proteinfamilie ist das biochemische Wissen sehr bescheiden. In diesem Projekt sollen daher, basierend auf umfangreichen phylogenetischen Voranalysen und der bereits erfolgreich durchgeführten rekombinanten Produktion von humanem Peroxidasin 1 in tierischen Zellkulturen, die Struktur-Funktionsbeziehungen von vier Peroxidasinen unterschiedlicher Entwicklungsstufe und Sequenz analysiert werden: Peroxidasin 1 von Caenorhabditis elegans, Pxd von Drosophila melanogaster als auch die beiden humanen Peroxidasine 1 & 2. Basierend auf der rekombinanten Produktion der vier Modell-Proteine in voller Kettenlänge bzw. von verkürzten Varianten unterschiedlicher Domänenzusammensetzung werden umfangreiche bio- chemische/biophysikalische Analysen durchgeführt: (i) UV-vis-, Fluoreszenz- Circular-dichroismus-, Mehrwinkellichtstreuung-, Resonanz Raman- und Elektronenspinresonanz-Spektroskopie, (ii) Multi-mixing- Stopped-flow-Spektroskopie und Polarographie, (iii) Massen-spektrometrie und Röntgenkristallographie, (v) Spektroelektrochemie und (vi) Kalorimetrie. Mit Hilfe dieser Methoden sollen Struktur und enzymatische Aktivität der Peroxidasine aufgeklärt werden wie z.B. (i) oligomere Struktur und Architektur des Substratkanals und des aktiven Zentrums, (ii) Interaktion der Domänen und Mechanismen bzw. Wege der Proteinfaltung bzw. Entfaltung in Peroxidasinen, (iii) Chemie der prosthetischen Gruppe inklusive Oxidations- und Spinzustände, Häm-Liganden und posttranslationale Modifizierungen, (iv) Natur und Spezifität von Substraten, Zugänglichkeit, Bindungorte von Substraten und Liganden als auch chemische Natur der Reaktionsprodukte (v) Chemie, Reaktivität und Relevanz von Redox-Intermediaten (z.B. Compounds I, II und III) sowie deren Thermodynamik und (vi) die Rolle von konservierten Aminosäuren in der Bindung und im Umsatz von Substraten. Klares Ziel dieses Projektes ist die Aufklärung der molekularen Basis der enzymatischen Aktivität von Peroxidasinen und die Präsentation der ersten hoch aufgelösten dreidimensionalen Strukturen dieser neuen Enzymklasse. Durch die vergleichende Analyse von Proteinen aus Invertebraten und Vertebraten werden zudem neue Erkenntnisse zur Evolution dieser Oxidoreduktasen und ihrer biologische Funktion(en) erzielt werden.

Enzyme der Peroxidase-Cyclooxygenase Superfamilie katalysieren biochemische Reaktionen, die in unzähligen biologischen Prozessen eine wichtige Rolle spielen, z.B. bei der unspezifischen Immunabwehr, der Synthese der Schilddrüsenhormone oder der Bildung und Modifizierung der extrazellulären Matrix. Sie sind zudem auch bei der Pathogenese von chronischen entzündlichen Erkrankungen beteiligt. In diesem Projekt wurde nun ein neuer Vertreter dieser Superfamilie, humanes Peroxidasin 1, erstmals rekombinant in tierischen Zellkulturen hergestellt und biochemisch umfassend charakterisiert. Es wurde gezeigt dass diese Häm-enthaltende Peroxidase sehr komplex gebaut ist und aus drei identen und hochglykosylierten Untereinheiten besteht. Jede Untereinheit wiederum enthält eine katalytische Häm-Domäne, Leucin-reiche Wiederholungssequenzen, Immunoglobulin C-ähnliche Domänen sowie den sog. Willebrandfaktor C enthalten. Diese Strukturmotive finden sich in vielen extrazellulären Molekülen, die mit anderen Proteinen in Wechselwirkung treten. Im Falle des humanen Peroxidasins 1, dass in den extrazellulären Raum sezerniert wird, dienen diese Untereinheiten wahrscheinlich ebenfalls der gezielten Wechselwirkung mit anderen Matrixproteinen und in der Folge mit Kollagen IV. Diese Arbeit zeigt klar, dass humanes Peroxidasin 1 mittels Wasserstoffperoxid sehr effizient Bromid in Hypobromit umwandeln kann. Mit Hilfe dieses starken Oxidationsmittels wird nun gezielt im Kollegen IV eine spezifische kovalente Kohlenstoff-Stickstoffbindungen generiert, ein Prozess, der sowohl bei der Gewebsbildung als auch bei zahlreichen Kranksheitsbildern eine wichtige Rolle spielt. Dies ist zudem die erste nachgewiesene biochemische und physiologische Rolle des Spurenelements Brom im menschlichen Körper.Neben dem vollständigen mehr als 500 kDa schweren homotrimeren Protein wurden in dieser Arbeit auch mehr als 15 verkürzte Varianten designt und untersucht, um den Einfluss der Domänen auf die Funktionalität zu studieren bzw. Strukturinformation mittels Röntgenkristallographie, Kleinwinkellichtstreuung und Elektronenmikroskopie zu erhalten. Niedrig aufgelöste Strukturen konnten bereits erhalten werden und zeigen die dreidimensionale Anordnung dieses komplexen Biomoleküls. Zudem erlaubten diese Varianten die erstmalige vollständige Untersuchung des Halogenierungs- und Peroxidase-Zyklus inklusive sämtlicher relevanter Redoxintermediate dieses Enzyms. Nachfolgende Untersuchungen fokussieren sich nun auf den Erhalt hochaufgelöster Röntgenstrukturen und die Interaktion mit potentiellen Bindungspartnern in der extrazellulären Matrix. Außerdem soll die Funktionalität des humanen Peroxidasin 2 aufgeklärt werden.