Entschlüsselung von Histomonas meleagridis Virulenzfaktoren

Die Histomonose oder Schwarzkopfkrankheit wird verursacht durch den Parasiten Histomonas meleagridis. Der Erreger kommt sowohl bei Puten, mit einer sehr hohen Mortalität, als auch bei Hühnern, mit milderen Symptomen aber mit hoher Morbidität, vor. Zahlreiche Vögel die zu den galliformen gehören gelten als empfänglich. In den letzten Jahren wurden in der EU und den USA nahezu sämtliche Prophylaktika und Therapeutika bei lebensmittelliefernden Tieren verboten. In Folge dieses Verbotes wird vermehrt von Krankheitsausbrüchen berichtet, bis hin zum Verlust ganzer Bestände. Die aktuellen Entwicklungen haben das Fehlen von Grundlagenforschungsarbeiten zur Erforschung des Einzellers H. meleagridis und damit der Histomonose, offenbart. Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, H. meleagridis mittels molekularbiologischer Methoden näher zu untersuchen. Insbesondere sollen Untersuchungen zu Virulenzfaktoren, mithin Proteine die für Virulenz des Erregers wichtig sind, identifiziert und charakterisiert werden. Um einzelne Virulenzfaktoren von H. meleagridis zu identifizieren, wird eine vergleichende Proteom und Sekretom Analyse benutzt. Dazu werden solche Proteine die, ausschließlich oder in höherer Menge, im sehr virulenten Stamm vorkommen bestimmt und anschließend mittels Massenspektroskopie charakterisiert und analysiert. Um diese Daten zu unterstützen, Transkriptom-Differenzen zwischen virulenten und avirulenten Stamm werden zusätzlich untersucht. Proteine mit erheblicher Homologie zu schon beschriebenen Virulenzfaktoren von anderen Protozoen, so wie die unbekannten Proteine mit auffälliger Präsenz im sehr pathogenen H. meleagridis Stamm, werden auf verschiedenen Ebenen weiter untersucht. Ziel ist es, den jeweiligen Genlocus, den Transkriptions-Start, die Länge und Häufigkeit des Transkriptes, so wie die Fähigkeit eine Immunantwort im Wirt auszulösen, zu erforschen. Zusätzlich wird die Funktion der sezernierten Proteine auf die Virulenzfähigkeit von H. meleagaridis analysiert. Letztlich soll der Wert der ausgewählten Proteine für diagnostische Untersuchungen geprüft werden.

Ziel des vorliegenden Projektes war es, vermeintliche Virulenzfaktoren von Histomonas meleagridis zu identifizieren und zu charakterisieren und damit zu einem besseren Verstehen der Molekularmechanismen beizutragen, die dieser bedeutende Geflügelparasit zur Besiedlung des Wirtes nutzt. Der einzelliger Parasit, H. meleagridis, ist der ätiologische Erreger der Histomonose (Syn.: Schwarzkopfkrankheit). Unbehandelt kann die Histomonose zum Verlust ganzer Putenherden führen, während die Krankheit bei Hühnern weniger schwerwiegend ist. Diese weltweit verbreitete Geflügelkrankheit wurde über Jahrzehnte durch die Verwendung von Chemotherapeutika zur Prävention und Behandlung kontrolliert. In den letzten Jahren haben Änderungen in der Arzneimittelgesetzgebung in der Europäischen Union und den USA zu einem Wiederauftreten der Histomonose geführt. Durch die zunehmende Beliebtheit von Freilandhaltung und dem damit einhergehenden Infektionsrisiko, kommt es ebenfalls zu einem verstärkten Wiederauftreten der Krankheit. In vivo Versuche an der Klinik für Geflügel- und Fische der Veterinärmedizinischen Universität in Wien haben gezeigt, dass eine tödliche Histomonose durch Impfung mit einem abgeschwächten Parasitenstamm verhindert werden kann; kommerziell verfügbare Prohylaxe- und Therapiestrategien sind jedoch immer noch nicht verfügbar. Angesichts des Ausnahmezustands mit zahlreichen Ausbrüchen in jüngster Zeit wird die Entwicklung neuer Präventionsansätze zur Notwendigkeit. Ein grundlegender Schritt in die Richtung ist es, die Virulenz- und Abschwächungsmechanismen des Parasiten zu verstehen. Mit diesem Ziel konzentrierte sich das vorliegende Projekt auf die vergleichende Analyse der löslichen zellulären und sezernierten Proteine (Proteom und Exoproteom) von virulenten und attenuierten H. meleagridis-Stämmen. Angesichts der Tatsache, dass das Genom dieses Parasiten immer noch nicht sequenziert ist, wurde eine de-novo-Transkriptomanalyse beider Stämme unternommen, um wesentliche genomische Informationen über diesen Einzeller zu gewinnen und die Proteomanalyse zu unterstützen. Alle Analysen verwendeten in vitro- Kulturen von virulenten und attenuierten H. meleagridis-Stämmen, die von einer einzelnen Parasitenzelle stammten und im Hintergrund eines einzelnen Bakterienstamms vermehrt wurden. Die Proteomstudie identifizierte die Proteine, die zwischen virulenten und attenuierten H. meleagridis-Parasiten differentiell reguliert sind. Die differentielle Regulierung der Proteine spiegelte häufig den Anpassungsprozess des Parasiten an die Bedingungen in- vitro wider. Neben Proteinen, die mit der Anpassung an das Wachstum in-vitro in Zusammenhang stehen, deutet die Hochregulierung mehrerer Cysteinpeptidasen und post- translational modifizierter ubiquitärer zellulärer Proteine im virulenten Stamm auf ihren möglichen funktionellen Beitrag zur Virulenz hin. Zusätzlich zu Unterschieden in der Regulierung von Parasitenproteinen wurden Unterschiede in der Expression von bakteriellen Proteinen in Bezug auf den Parasitenphänotyp gefunden. Dies war besonders auffallend in der Exoproteom-Analyse. Die de-novo-Transkriptom-Analyse von virulentem und attenuiertem H. meleagridis führte zur Etablierung des Referenz-Transkriptoms für H. meleagridis. Die Genontologieanalyse der Transkriptom-Daten und die gezielte Datensuche lieferten neue molekulare Erkenntnisse zu verschiedenen Aspekten der Zellbiologie, Umweltadaptation und potentielle pathogene Mechanismen von H. meleagridis. Außerdem wurden die Transkriptom-Daten in einer in-sillico-Arzneistoff-Überprüfung verwendet, um potentielle anti-H. meleagridis Arzneistoffe zu identifizieren. Zusammengefasst ermöglichen Proteom- und Transkriptomdaten ein besseres Verstehen der molekularen Biologie des Parasiten, was die Entwicklung neuer Diagnostika und zukünftiger Forschung unterstützt. Die Erkenntnis der bakteriellen differentiellen Proteinregulierung, in Bezug auf den Parasitenphänotyp, unterstützt die Ansicht der Wechselbeziehung zwischen H. meleagridis und den co-kultivierenden Bakterien. Damit liegt nicht nur eine reine Raubtier-Beute- Beziehung vor, deren Verständnis für die Implementierung von Präventionsstrategien große Bedeutung zukommt.