Dihydro-p-coumaroyl-CoA-Dehydrogenase: Schlüsselenzym der Phloridzinbiosynthese

Dieses Projekt untersucht den ersten Schritt der Biosynthese des Dihydrochalkons Phloridzin in der Modellpflanze Apfel (Malus domestica), das mehr als 90% der löslichen phenolischen Inhaltsstoffe in Apfelblättern darstellt. Diese großen Mengen an Phloridzin machen den Apfel einzigartig, da viele andere Arten nur sehr geringe Mengen bilden und viele eng verwandte Arten, wie Pyrus communis (Birne) weder Phloretin noch Phloridzin bilden können. Während es zahlreiche Berichte über die positiven Effekte von Phloridzin auf den menschlichen Organismus gibt, ist die physiologische Rolle von Phloridzin im Apfel noch immer nicht geklärt. Eine Beteiligung in der Resistenz gegen Krankheiten wird immer wieder diskutiert. Vor kurzem konnten wir zeigen, dass die Bildung von Phloridzin auf drei Biosyntheseschritten beruht: (1) die Bildung von Dihydro-p-coumaroyl A-Ester aus p-Coumaroyl-CoA, (2) die Bildung von Phloretin durch die Chalkonsynthase und (3) die Glucosylierung von Phloretin an der Position 2. Während die letzten beiden Schritte schon gut untersucht sind, ist der erste Schritt noch weitgehend unbekannt. Es ist der entscheidende Schritt, der den Apfel im Vergleich zu anderen Pflanzen in seiner Fähigkeit, große Mengen an Dihydrochalconen zu bilden, einzigartig macht. Die Reaktion wurde mit Rohextrakten aus Apfelblättern nachgewiesen und charakterisiert. Sie zeigt Ähnlichkeiten mit der Reduktion von Doppelbindungen bei mittelkettigen Fettsäuren oder Phenylpropenaldehyden in der Ligninbiosynthese. Bisherige Versuche, das entsprechende Gen zu klonieren waren nicht erfolgreich, da wegen der Neuheit des Enzyms nicht auf brauchbare Sequenzhomologien zurückgegriffen werden kann. In diesem Projekt soll das Enzym aus Apfelblättern gereinigt und charakterisiert werden. Das gereinigte Protein wird ansequenziert um das codierende Gen im Apfelgenom identifizieren und anschließend isolieren zu können. Für Rückschlüsse auf den Reaktionsmechanismus, Substratspezifität und Cofaktorbindung soll das Protein kristallisiert werden. Die Arbeiten auf molekularer Ebene schließen eine die Isolierung und Charakterisierung auf Ebene des Strukturgens und der Promotorregion, Untersuchungen auf das Vorhandensein von Genfamilien, eine Analyse der phylogenetischen Verwandtschaft, gewebespezifische Expression und Abhängigkeit von der ontogenetischen Entwicklung ein. Die funktionelle Aktivität in vivo soll anhand von transienter oder stabiler Expression in der Modellpflanze Fragaria vesca demonstriert werden. Für zukünftige Forschung soll das Gen im Apfel ausgeschaltet werden und in der Birne überexpremiert werden. Die Herstellung und Untersuchung solcher Modellpflanzen wird in diesem Projekt initiiert werden, ist aber ist im vorhanden zeitlichen Rahmen dieses Projekts nicht möglich.

Das Projekt beschäftigte sich mit der Biosynthese von Phloridzin, welches die vorherrschende polyphenolische Substanz in Apfel ist und eine gesundheitsfördernde Wirkung beim Menschen hat. Phloridzin repräsentiert mehr als 90% der löslichen Phenole in Apfelblättern. Die Anwesenheit hoher Mengen an Phloridzin ist typisch für den Apfel, während andere Pflanzen nur sehr niedrige Mengen bilden bzw. nah verwandte Arten wie die Birne gar nicht in der Lage sind, Phloretin oder das Glucosid Phloridzin herzustellen. Wir isolierten zum ersten Mal einen neuen Enzymkandidaten aus Apfelblättern, der den entscheidenden Schritt in der Biosynthese der Dihydrochalkone Phloretin und Phloridzin katalysiert. Das Enzym zeigt eine hohe Doppelbindungs-Reduktase-Aktivität mit p-Coumaroyl-CoA als Substrat und erzeugt dabei Dihydro-p-coumaroyl-CoA, der Vorstufe der Dihydrochalkone. Weiters etablierten und optimierten wir ein Protokoll zur Produktion des Enzyms in Bakterien, was z.B. für die Produktion von großen Mengen des Enzyms notwendig ist. Die Chalkonsynthase (CHS) katalysiert den zweiten Schritt in der Dihydrochalkon-Biosynthese. Wir untersuchten fünf verschiedene CHS aus Apfel und zeigten, dass keine davon p-Dihydrocoumaroyl-CoA oder p-Coumaroyl-CoA als Substrat bevorzugt. Damit ist die CHS nicht ausschlaggebend dafür, ob Dihydrochalkone in Pflanzen gebildet werden oder nicht. Die Hydroxylierung von Phloretin zu 3-Hydroxyphloretin ist ein weiterer wichtiger Schritt in der Dihydrochalkon- Biosynthese. Wir konnten zeigen, dass die F3H (Flavonoid 3-Hydroxylase) nicht in der 3- Hydroxyphloretin-Biosynthese beteiligt ist. Im Gegensatz dazu konnten wir mit Apfelproteinextrakt und rekombinanter Polyphenoloxidase eine spezifische Hydroxylierung von Phloretin zu 3-Hydroxyphloretin nachweisen. Zusätzlich fanden wir eine verschiedene Dihydrochalkon-Konzentration und auch 3-Hydroxyphloretin-Bildung in Abhängigkeit des Gesundheitszustandes von Apfelfrüchten (Glasigkeit vs. gesunde Früchte) was die Identifikation von Doppelbindungs-Reduktasen in einem zusätzlichen molekularbiologischen Forschungsansatz ermöglichen könnte. Insgesamt konnte in dem Projekt ein wesentlicher Schritt in Richtung endgültiger Aufklärung der Dihydrochalkon-Biosynthese gemacht werden. Zusätzlich führen neue Erkenntnisse zur CHS und F3H zum besseren Verständnis in Teilen des generellen Flavonoid-Stoffwechsels. Im Gegensatz zur arbeitsaufwändigen Isolierung von einzelnen Dihydrochalkonen aus Pflanzenmaterial könnten diese effizient mit der rekombinanten Doppelbindungs-Reduktase hergestellt werden. Ein genaueres Verständnis der Dihydrochalkon-Biosynthese auf Ebene der Gene und Enzyme könnte tiefere Einsichten in die gesundheitliche Wirkung von bestimmten Pflanzen, sowie die Optimierung der Ernährung in Hinblick auf den Dihydrochalkongehalt ermöglichen.