Vergleichende Studien über Chloritdismutasen

Eine kleine Gruppe von Mikroorganismen kann Perchlorat und Chlorat und Chlorat zu Chlorit mit Hilfe einer Perchloratreduktase reduzieren. Das Schlüsselenzym dieser (Per)chlorat-reduzierenden Bakterien ist die Häm b Oxidoreduktase Chloritdimutase (Cld), die das toxische Chlorit in harmlosen Sauerstoff und Chlorid umwandelt. Bislang vermutete man, dass Clds nur in fakultativ anaeroben heterotrophen Proteobakterien vorkommen, doch neuere Sequenz- und phylogenetische Analysen zeigen nun, dass diese Enzyme in Bakterien und Archaeen weit verbreitet sind. Dies eröffnet nun erstmals die Möglichkeit eine umfassende und vergleichende Studie der biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften dieser Enzymklasse durchzuführen. Basierend auf der erfolgreichen rekombinanten Produktion und Strukturaufklärung der Clds aus Nitrospira defluvii and Nitrobacter winogradskyi, die eine vergleichbare enzymatische Aktivität aber signifinante Unterschiede im Aufbau der Untereinheiten als auch im Oligomerisierungsgrad aufweisen, sollen in diesem Projekt, neben diesen beiden Enzymen noch die Clds aus Bradyrhizobium japonicum und dem Cyanobakterium Cyanothece sp. PCC7425 untersucht werden. Diese vier Oxidoreduktasen werden rekombinant produziert und mittels einer breiten Palette an Methoden analysiert (UV-vis-, Circular Dichroismus-, Resonanz Raman-, Elktronenspin-Resonanz-Spektroskopie, Spektroelektrochemie, Röntgenkristallographie). In Kombination mit ortsspezifischer Mutagenese soll ein allgemein gültiger Reaktionsmechanismus des Chloritabbaus gefunden werden, der möglicherweise die Bildung eines Ferryl-Porphyrylradikal-Intermediates und die Rekombination mit zwischenzeitlich gebildeten Hypochlorit umfasst. Dabei wird eine neue O-O-Bindung gebildet und Chlorid freigesetzt. Im Rahmen des Projekts sollen der Zugang und die Bindung von Liganden und Substraten im aktiven Zentrum, die Rolle des Proteins in der Redoxregulation, die tatsächliche elektronische Struktur, Reaktivität und Kinetik der Umwandlung der beteiligten Reaktionsintermediate und der Elektronenübertragungsweg untersucht werden. Nachdem sich die vier Modellproteine sowohl in der Struktur der Untereinheiten als auch im Oligomersierungsgrad signifikant unterscheiden, soll auch der Effekt auf die Konformations- und Temperaturstabilität analysiert werden. Die Daten werden neue Einsichten in die Biokatalyse von Hämenzymen bieten und auch die biotechnologische Anwendung von Chloritdismutase im Abbau von anthropogen produzierten Chlorit forcieren. Das Projekt wird im Verbund mit international renommierten ForscherInnen durchgeführt: Prof. Smulevich (Florenz, Italien, Resonanz Raman Spektroskopie), Prof. Battistuzzi (Modena, Italien, Spektroelektrochemie) und Prof. Djinovic-Carugo (Röntgenkristallographie, Wien).

Eine kleine Gruppe von Mikroorganismen kann mit Hilfe einer Perchloratreduktase Perchlorat zu Chlorat und Chlorat zu Chlorit reduzieren. Das Schlüsselenzym dieser (Per)chlorat-reduzierenden Bakterien ist die Häm b Oxidoreduktase Chloritdimutase (Cld), die das toxische Chlorit in harmlosen Sauerstoff und Chlorid umwandelt. Bislang vermutete man, dass Clds nur in fakultativ anaeroben heterotrophen Proteobakterien vorkommen, doch neuere Sequenz- und phylogenetische Analysen zeigen nun, dass diese Enzyme auch in Bakterien und Archaeen weit verbreitet sind. Dies eröffnete nun erstmals die Möglichkeit eine umfassende und vergleichende Studie der biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften dieser Enzymklasse durchzuführen.Basierend auf der erfolgreichen rekombinanten Produktion der Clds aus Nitrospira defluvii, Nitrobacter winogradskyi, Cyanothece sp. PCC7425 und dem der chloritdismutase-ähnlichen Protein aus Listeria monocytogenes konnten diese mittels einer breiten Palette an biophysikalischen und biochemischen Methoden erfolgreich charakterisiert werden. Im aktuellen Projekt konnten wir einerseits die Interaktion von Chlorit mit den Hemenzymen und deren biologische Rolle sowie die phylogenetische Abstammung herausarbeiten und andereseits die Struktur unterschiedlicher funktioneller und nicht funktioneller Chloritdismutasen mit unterschiedlicher Gesamtstruktur als auch unterschiedlicher Untereinheitenstruktur erfolgreich auflösen. Mit Hilfe von experimentellen als auch computerunterstützen Methoden, konnten wir einen allgemein gültigen Reaktionsmechanismus des Chloritabbaus ableiten. Dieser beinhaltet das Binden von Chlorit an das Enzym, gefolgt von der Bildung eines Ferryl-Porphyrylradikal-Intermediates und die Rekombination mit dem zwischenzeitlich gebildeten Hypochlorit. Schlußendlich endet die Reaktion mit der Bildung einer neuen O-O-Bindung und der Sauerstoff und Chlorid Freisetzung. Dabei wurde auch die Rolle des für Chloritdismutasen typischen Arginins, als auch das kurzzeitlich entstehende Hypochlorit in der Hemmung der Aktivität untersucht. Basierend auf unseren Analysen und den vorhandenen Daten können Chloritdismutasen für die biotechnologische Anwendung im Abbau von anthropogen produzierten und im Grundwasser, Trinkwasser und Böden detektierten Chlorit, forciert werden.