Die Rolle von Cholesterin in der Regulation von Orai Kanälen

Die beiden Proteine STIM1 und Orai sind ausreichend um den sehr gut charakterisierten Kalzium Einstrom "CRAC (Ca 2+ release-activated Ca2+) current" in die Zelle vollständig herzustellen. Zusätzlich regulieren eine Reihe anderer Proteine, wie beispielsweise SARAF, Junctate oder CRACR2A die STIM1/Orai-Signalkaskade. Nachdem STIM1 und Orai1 in Cholesterin-reichen Mikrodomänen in Zellmembranen detektiert wurden, behandelt dieses Projekt die Rolle von Cholesterin in der STIM1/Orai Regulierung. Meine ersten Experimente ergaben, dass eine chemisch induzierte Cholesterinentleerung der Plasmamembran, STIM1/Orai Ca2+ Ströme um das doppelte ansteigen lässt. Die Aminosäurensequenz des Orai N-terminus enthält eine mögliche Cholesterinbindestelle, welche perfekt mit dem Konsensusmotiv der sogenannten Cholesterinbindestelle "CRAC (cholesterol recognition/interaction consensus) motif" übereinstimmt. Weiters ist das Kriterium, dass das CRAC Motiv in der Nähe eine Transmembrandomäne auftreten sollte, erfüllt. An anderen Proteinen wurde bereits nachgewiesen, dass spezifische Punktmutationen das CRAC Motiv schwächen oder zerstören. Eine analoge Mutation in Orai1 zeigte einen vergleichbaren Anstieg des Ca2+ Stroms wie für Wildtyp-Proteine nach der Cholesterinentleerung der Plasmamembran. Desweiteren konnte mit Zirkulardichroismus nachgewiesen werden, dass ein Peptid des Aminoterminus, welcher das CRAC motif enthält, zum Teil eine alpha-helix bildet, welches ein weiteres Kriterium für das CRAC motif darstellt. Erste Fluoreszenzmessungen ergaben, dass die intrinsische Tryptophan- bzw Tryosin-Fluoreszenz in Gegenwart von Cholesterin wesentlich höhere ist, als in dessen Abwesenheit und zudem zeigt das Fluoreszenzmaximum eine Verschiebung, welche möglichweise auf eine stärker gefaltete Struktur hindeutet. Auf der Basis dieser ersten Ergebnisse möchte ich die Rolle von Cholesterin in der Regulation von STIM1/Orai einerseits funktionell mittels Ca2+ Konzentrations- wie auch elektrophysiologischen Messungen bestimmen. Andererseits werde ich mit Hilfe von biochemischen Methoden die direkte Bindung von Cholesterin an den Orai Aminoterminus nachweisen wie auch deren Bindung mittels Zirchulardichroismus und NMR strukturell auflösen. Weiters werden diese Studien durch die Bestimmung der Rolle von Cholesterin in Mastzelllinien wie auch Prostatakrebszelllinien vervollständigt. Zusammenfassend geben diese Analysen Einsicht in die Rolle von Cholesterin in der Regulation von Orai und lösen die Cholesterin Bindungsstelle strukturell auf.

Kalzium (Ca2+) Ionen spielen eine bedeutende Role im Immunsystem. Einer der bekanntesten Eintrittswege für Ca2+ in die Zelle sind die sogenannten Ca2+-release-activated Ca2+ (CRAC) - Ionenporen, welche sich in der Zellmembran befinden. Dieser Ca2+ Ionenkanal setzt sich aus zwei Komponenten: das STIM1- and Orai1-Protein zusammen. Im Rahmen dieses FWF-Projektes (P25210) wurde ein neues Konzept der Regulation dieser CRAC Ionenkanäle durch Cholesterin im Fachmagazin Science Signaling publiziert. Es wurde zum ersten Mal gezeigt, dass Cholesterin den Transport von Ca2+ über das Orai Protein in die Zelle senkt. Hiermit kann möglicherweise erklärt werden, warum Patienten mit einer beeinträchtigten Synthese von Cholesterin anfälliger für Allergien sind. Cholesterin zählt zu einem wichtigen Baustein der Zellmembranen bei Mensch und Tier. Wir haben zusammen mit einem internationalen Team das Cholesterin in der Zellmembran von Immunsystem- und Nierenzellen chemisch stark verringert und im Anschluss die Aktivität der Orai1 Kalzium-Ionenporen in der Zellmembran beobachtet. Normalerweise lassen diese Ionenporen nur dann Kalzium in die Zelle hinein, wenn es dort knapp wird. Hier konnten wir zeigen, dass eine Senkung des Cholesterinspiegels in den Membranen zu einer erhöhten Aktivität dieser Kalzium-Poren und somit zu einem erhöhten Kalzium- Einstrom in die Zelle führt. Daraufhin schütten sogenannte Mastzellen (das sind Immunzellen, welche eine wichtige Rolle bei allergischen Reaktionen spielen) vermehrt Allergie-erregende Stoffe wie Histamine aus. Diese Abläufe könnten erklären, warum Personen mit einer Stoffwechselkrankheit namens Smith- Lemli-Opitz-Syndrom zu Allergien neigen. Diese Patienten weisen ein defektes Enzym auf, wodurch die Cholesterinsynthese nicht richtig ablaufen kann. Aus diesem Grund haben diese Patienten sehr wenig Cholesterin in den Zellmembranen, und bei ihnen wurde schon von einer anderen Forschungsgruppe eine erhöhte Freisetzung von Histaminen und anderen Allergie-erregenden Stoffen beobachtet. Cholesterin hemmt den Kalzium-Einstrom durch direkten Kontakt mit der Orai1-Pore. Mutationen an Orai1, welche die Bindung von Cholesterin hemmen, führen ebenfalls zu einer erhöhten Aufnahme von Kalzium, wie die Linzer Wissenschafter gemeinsam mit zwei anderen Forschungsgruppen in Graz und in Toronto (Kanada) zeigen konnte.