Gerichtete Evolution einer Laccase mit hohem Redoxpotential

Laccasen sind Oxidoreduktasen, die eine vier Elektronen Reduktion von O 2 zu Wasser in Verbindung mit der Oxidation von kleinen, organischen, haupsächlich aromatischen Substraten katalysieren. Sie werden nach dem Redoxpotential des T1 Kupferzentrums in Laccasen mit hohem, mittleren und niedrigem Redoxpotential eingeteilt. Ausschließlich Laccasen aus Pilzen, besonders aus Basidiomyzeten, besitzen ein hohes Redoxpotential. Diese Enzyme eigenen sich besonders für eine große Zahl an biokatalytischen Anwendungen, sowie als Kathodenenzym für Biosensoren und Biobrennstoffzellen. Der Einsatz dieser hochinteressanten Enzyme ist allerdings durch ihre Inhibierung durch Hydroxidionen eingeschränkt, die zu einer faktischen Inaktivierung bei pH Werten über 6.5 führt. Trotz der Bedeutung der Inhibierung durch Hydroxidionen und andere Anionen (Chlorid, Fluorid) für Laccasen mit hohem Redoxpotential, wurde weder der genaue Mechanismus der Inhibierung noch die Bindungsstellen der Inhibitoren genauer untersucht. Die pH Profile der Laccase aus dem Basidiomyzeten Trametes versicolor ähneln denen von vielen anderen, publizierten Laccasen und stimmen mit der gängigen Theorie, dass Hydroxidionen bei neutralem pH am T2/T3 Kupferzentrum binden, überein. Allerdings haben die Laccasen sowohl aus dem Ascomyzeten Melanocarpus albomyces und aus dem Lackbaum Rhus vernicifera andere pH Profile mit verschiedenen Substraten, die dieser Theorie widersprechen. Bisherige Forschungsergebnisse unter Verwendung von rationalem Protein-Engineering haben zwar Effekte auf das pH-Verhalten gezeigt, aber bisher nicht die Fragen beantwortet, wo die Inhibierung stattfindet, welche Aminosäuren beteiligt sind und ob eine Änderung im pH Verhalten auch Einfluß auf die Inhibierung durch andere Anionen hat. Das Hauptziel des vorgeschlagenen Forschungsprojektes ist die Aminosäure-Positionen, Seitenketten und damit strukturellen Eigenschaften, die für die Inhibierung von Laccasen mit hohem Redoxpotential durch Hydroxidionen (pH-Abhängigkeit) verantwortlich sind, zu identifizieren. Wir schlagen vor, gerichtete Enzym-Evolution zu verwenden, um Hotspots, die die Inhibierung durch Hydroxidionen beeinflussen, zu finden. Dem Einfluss dieser Hotspots wird durch semi-rationalem Engineering weiter auf den Grund gegangen werden. Die Mutationen im Laccase Gen, die zu einer Enzym-Variante mit höherer Aktivität bei neutralem pH-Wert führen, werden identifiziert werden und a posteriori die Aufklärung der Struktur-Funktions-Beziehung verantwortlich für das pH- Verhalten und die Inhibierung durch Anionen im Allgemeinen ermöglichen. Ein besseres Verständnis der Struktur - Funktions-Beziehung für das unterschidliche pH-Verhalten von Laccasen wird dazu beitragen, Designer Laccasen mit einem optimalen pH-Bereich für eine jeweilige Anwendung zu konstruieren.

Laccasen sind Enzyme, die Elektronen mit Hilfe zweier Kupferzentren auf Sauerstoff übertragen und diesen damit zu Wasser reduzieren können. Sie haben jeweils ein T1 Zentrum, das aus einem Kupferatom besteht und ein T2/T3 Zentrum, in dem sich 3 Kupferatome befinden. Laccasen mit einem hohen Redoxpotential an diesem T1 Zentrum, wie sie in Pilzen vorkommen, eignen sich als Teil eines Biosensors oder einer Biobrennstoffzelle. Damit könnte man in Zukunft sehr kleine Geräte, etwa im Körper betreiben ohne Batterien zu benötigen. Für Bedingungen, wie sie etwa im Blut herrschen, sind Laccasen aber nicht besonders gut geeignet. Zum einen arbeiten sie bei neutralem pH nur mehr sehr langsam und zum anderen werden die meisten von Chlorid Ionen inhibiert. In diesem Projekt wurde die Abhängigkeit der Aktivität einer Laccase vom pH-Wert sowie im Weiteren von der Chlorid Ionen Konzentration untersucht. Dafür wurde die Aminosäurezusammensetzung des Enzyms durch zufällige sowie gezielte Mutationen verändert und nach Enzymvarianten gesucht, deren pH Abhängigkeit sich vom ursprünglichen Enzym unterscheidet. Gleichzeitig wurden die Varianten auf höhere Stabilität geprüft. Nach der Untersuchung von mehreren Zehntausenden von Varianten wurden dreizehn mit verändertem pH Verhalten und eine mit einer höheren Stabilität gefunden und genauer charakterisiert. Dabei wurde vor allem auf den Zusammenhang von Aminosäurestruktur und der Aktivität geachtet, wofür die genaue Struktur des Enzyms aufgeklärt worden war. Es konnte gezeigt werden, dass das pH-Verhalten anders als bisher angenommen, stark von Veränderungen am T1 Kupferzentrum abhängig ist, dabei Änderungen des Redoxpotentials aber nur eine untergeordnete Rolle spielen. Außerdem wurde festgestellt, dass Chlorid Ionen ebenfalls am T1 Zentrum angreifen. Diese wichtigen Erkenntnisse tragen zum besseren Verständnis der Funktionsweise von Laccasen bei und bringen sie damit einer zukünftigen Anwendung in Biobatterien näher.